Т-КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ У ДЕТЕЙ С ТИМОМЕГАЛИЕЙ

Полный текст

Тимомегалия (лат. Thymus - тимус, megalia - увеличение) - это состояние, наблюдающееся преимущественно у детей раннего возраста, при котором отмечается увеличение объёма и массы вилочковой железы выше предельных возрастных значений с сохранением нормальной морфологической структуры этого органа [1, 2]. В настоящее время для обозначения данного состояния часто используют термин «синдром увеличенной вилочковой железы» [3]. Существует точка зрения, что увеличение тимуса у детей грудного возраста является вариантом нормы, но есть и противоположное мнение, рассматривающее тимомегалию как патологию: проявление аномалии развития и функционирования нейро-иммунно-эндокринной системы [1, 4, 5]. В ряде работ показано, что дети с увеличением вилочковой железы чаще болеют инфекционно-воспалительными и аллергическими заболеваниями с осложнённым течением, нередко заканчивающимся неожиданным летальным исходом [6, 7]. В зарубежной литературе проблема увеличенной вилочковой железы в основном рассматривается в плане дифференциальной диагностики с опухолями тимуса (при миастении) и средостения, перикардитом, плевритом и другими состояниями [8-10]. Таким образом, единого мнения относительно природы и клинической значимости тимомегалии до сих пор не сложилось [6, 11]. Неясно, следует ли рассматривать увеличение размеров тимуса как первичный процесс [7, 12], отражающий дефект развития этого органа и проявляющийся иммунодефицитом, или это вторичное проявление нарушений эндокринной регуляции тимуса с первичной гипофункцией коры надпочечников [5, 13]. Поскольку тимус является центральным органом иммунной системы, в котором осуществляется развитие, созревание и дифференцировка Т-лимфоцитов, можно предположить нарушение Т-клеточного иммунитета при тимомегалии. Действительно, в предыдущих работах обнаружены признаки гипофункции Т-клеточного звена иммунной системы: снижение численности Т-лимфоцитов и изменение их субпопуляционного состава [3, 6, 7, 11]. В настоящей работе, помимо оценки субпопуляционного состава Т-лимфоцитов (в том числе Т-регуляторных клеток), мы оценили функциональную активность тимуса и Т-лимфоцитов при тимомегалии. Функциональную активность тимуса оценивали по содержанию в Т-лимфоцитах крови Т-рецепторных эксцизионных колец (ТРЭК), которые представляют собой кольцевидные структуры ДНК, образующиеся в процессе перестройки генов Т-клеточного рецептора в тимусе, коррелирующие с интенсивностью Т-лимфопоэза и эмиграцией Т-клеток из тимуса [14, 15]. Материал и методы Обследовано 70 детей с тимомегалией в возрасте до 1 года, находившихся на стационарном лечении в Морозовской детской клинической больнице в связи с заболеваниями респираторного тракта (ОРВИ, обструктивные бронхиты). Группа сравнения включала 25 детей без тимомегалии с ОРВИ/обструктивным бронхитом. Содержание ТРЭК определяли у 32 детей с тимомегалией и у 18 детей без тимомегалии в возрасте до 1 года. Размер тимуса устанавливали рентгенологически на основе величины кардио-тимико-торакального индекса (КТТИ): отношение ширины тимуса к ширине грудной клетки на уровне куполов диафрагмы. Тимомегалия I степени (КТТИ 0,33-0,36) выявлена у 9 детей, II (КТТИ 0,37-0,42) - у 40, III (КТТИ 0,43 и более) - у 21 ребёнка. Из периферической крови обследованных детей выделяли мононуклеарную фракцию путём центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности фиколла-верографина (плотность 1,077 г/мл) по методу A. Boyum [16]. Мембранный фенотип клеток оценивали методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител, меченных флуорохромами. Клетки инкубировали с моноклональными антителами в PBS (фосфатно-солевом буфере) с 1% BSA (бычьим сывороточным альбумином) и 0,1% NaN3 в течение 30 мин при +4°C. Использовали моноклональные антитела к CD3, CD4, CD8, меченные флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), и антитела к CD25, HLA-DR, меченные фикоэритрином (PE) (Becton Dickinson). Лазерную цитометрию клеток осуществляли на проточном цитометре BD FACSCanto™ II (Becton Dickinson) в стандартном режиме. Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения FlowJo 7.6. Для оценки пролиферации лимфоцитов в культуру мононуклеаров крови (0,5 ∙ 106 на 1 мл среды) вносили фитогемагглютинин (ФГА) в конечной концентрации 10 мкг/мл и культивировали в течение 72 ч. За 18 ч до завершения культивирования в лунки вносили 40 кБк 3H-тимидина и оценивали включение тимидина на счётчике β-сцинтилляций. Результаты выражали в импульсах в минуту (имп/мин). Для оценки ответа лимфоцитов на действие митогенов рассчитывали индекс стимуляции: отношение включения метки в присутствии и в отсутствии митогена. Клетки, продуцирующие цитокины, определяли общепринятым методом [17]. Для индукции синтеза цитокинов к клеткам добавляли форболмиристат ацетат (ФМА, Sigma) в концентрации 25 нг/мл и иономицин (Sigma) в концентрации 1 мкг/мл. Для предотвращения выхода цитокинов из клеток добавляли брефелдин A (Golgy Plug, Becton Dickinson). После культивирования в течение 18 ч лимфоциты дважды отмывали, фиксировали 4% раствором параформальдегида в течение 10 мин при 4°C и дважды отмывали PBS. Лимфоциты пермеабилизировали в 0,1% растворе сапонина (Sigma) в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте. Для выявления внутриклеточных цитокинов к клеткам, осаждённым центрифугированием, добавляли антитела к CD3, меченные FITC, и антитела к IFNγ или к IL-4, меченные PE (Becton Dickinson). После 30-минутной инкубации при комнатной температуре в темноте клетки отмывали от несвязавшихся антител 0,1% раствором сапонина, фиксировали 1% параформальдегидом (Sigma) и исследовали методом проточной цитометрии. Для выделения нуклеиновых кислот (из 1 млн клеток) использовали наборы «Проба НК» (ДНК-Технология). Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически, соотношение A260/280 составляло 1,6-2,0. Для постановки ПЦР использовали набор реагентов TaqMan Univrsal PCR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosystems). Для определения ТРЭК использованы следующие праймеры: прямой 5’-CGT GAG AAC GGT GAA TGA AGA GCA GAC A-3’, обратный 5’-CAT CCC TTT CAA CCA TGC TGA CAC CTC T-3’, а также флуоресцентно-меченный олигонуклеотид (зонд) 5’-FAM-TTT TTG TAA AGG TGC CCA CTC CTG TGC ACG GTG A-MGB-3’ [14]. Расчёт количества копий ТРЭК проводили с использованием стандартной кривой, полученной по разведениям плазмиды с известной концентрацией ДНК ТРЭК. Результаты выражали числом копий ТРЭК на 1 тыс лимфоцитов. Для определения количества геномной ДНК использован β-актин (Applied Biosystems). Амплификацию осуществляли на приборе 7300 Applied Biosystems Real-time PCR System по следующей программе: 1 цикл - 50°C 2 мин, 95°C 10 мин; 50 циклов - 94°C 30 с, 60°C 30 с. Измерение уровня флуоресценции выполняли на каждом цикле при температуре 60°C. Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов непараметрического анализа. Исследованные количественные показатели представляли в виде Me (L-H), где Me - медиана, L - нижний квартиль, H - верхний квартиль. Для сопоставления двух групп по количественным признакам использовали U-критерий Манна-Уитни. Различие групп полагали статистически значимым при p < 0,05. Обработку проводили в программном пакете StatSoft Statistica 7.0. Результаты и обсуждение В табл. 1 и 2 представлены показатели, позволяющие сопоставить численность Т-лимфоцитов и их субпопуляций, а также некоторых активационных молекул на мононуклеарных клетках у детей с тимомегалией и в группе сравнения. Статистически значимые отличия всех детей с тимомегалией (независимо от степени процесса) от группы сравнения, обнаружены по всем исследованным показателям Т-клеточного иммунитета: все показатели у детей с тимомегалией были ниже, чем в группе сравнения. Обнаружено значимое снижение относительного и абсолютного содержания Т-клеток (CD3+), абсолютного содержания Т-хелперов (CD4+ Т-клеток), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+ Т-клеток) и регуляторных Т-клеток (CD4+ CD25hi). Также снижено содержание активированных Т-клеток (CD4+ CD25lo и CD3+ HLA-DR+). При сопоставлении изменений показателей со степенью тимомегалии в целом наблюдалось усиление их выраженности по мере прогрессирования тимомегалии, в наибольшей степени это касалось изменения содержания лимфоцитов (см. табл. 1 и 2). При тимомегалии I степени относительных изменений показателей Т-клеточного иммунитета не выявлено, однако наблюдалось снижение абсолютного содержания Т-клеток, в частности Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов и регуляторных Т-клеток (CD4+ CD25hi), уровень активационных молекул был в норме. При тимомегалии II степени изменения затрагивали все звенья Т-клеточного иммунитета, однако экспрессия молекул активации была не нарушена. При крайней степени тимомегалии (III) было снижено абсолютное содержание всех Т-лимфоцитов (Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов), также нарушена экспрессия активационных молекул, при этом уровень регуляторных Т-клеток увеличивался и приближался к показателям возрастной нормы. Подобные изменения могут свидетельствовать о декомпенсации процесса и нарастании иммунодефицита, поскольку регуляторные Т-клетки играют важную роль в подавлении иммунного ответа. При дополнительном изучении эффекта активации лимфоцитов in vitro (пролиферативный ответ на ФГА) отмечено некоторое снижение включения 3H-тимидина у детей с тимомегалей I и II степени, при тимомегалии III степени отмечалась тенденция к росту этого показателя (табл. 3). Однако статистически значимых изменений функциональной активности периферических Т-лимфоцитов не выявлено. Исследование содержания Т-клеток, продуцирующих ключевые цитокины Th1- и Th2-клеток (IFNγ и IL-4, соответственно) при стимуляции ФМА и иономицином in vitro, показало отсутствие значимых отклонений этих показателей от уровня в контроле. Исключение составило снижение абсолютного содержания Th2-клеток у детей с тимомегалией I степени. Причём, как следует из табл. 4, при тимомегалии I степени отмечалось снижение обоих типов цитокинпродуцирующих клеток по сравнению с контрольной группой (Th1 - статистически незначимо), при тимомегалии II степени выявлено приближение их к уровню контроля, а при тимомегалии III степени - относительное его превышение, хотя и незначимое статистически. Следовательно, способность Т-клеток к дифференцировке в цитокинпродуцирующие клетки типов Th1 и Th2 возрастает по мере увеличения выраженности тимомегалии, однако практически не выходит за рамки, свойственные группе сравнения. Итак, тимомегалия у детей сопряжена с Т-лимфопенией, затрагивающей как CD4+, так и CD8+ клетки, причём эти изменения нарастают параллельно увеличению степени тимомегалии. Поскольку увеличение размеров тимуса (тимомегалия) неизбежно сочетается с нарастанием числа тимоцитов, можно предположить «задержку» незрелых Т-клеток в тимусе и нарушение притока зрелых Т-клеток из тимуса в периферический отдел иммунной системы. В настоящей работе мы провели оценку содержания клеток, недавно эмигрировавших из тимуса, по уровню ТРЭК в мононуклеарах периферической крови. Было выявлено статистически значимое снижение числа копий ТРЭК в пересчете на 1 тыс лимфоцитов у детей с тимомегалией (табл. 5). Наблюдаемые различия высоко достоверны (p = 0,00078). Снижение числа ТРЭК не коррелировало со степенью выраженности увеличения тимуса (данные не представлены). Если сделать поправку на более низкое содержание Т-клеток у детей с тимомегалией (у детей с тимомегалией 4,19 млрд Т-клеток в 1 л крови при 5,51 млрд Т-клеток в группе сравнения, т. е. в 1,32 раза меньше), полученная величина будет ещё ниже, чем в группе сравнения - 119,6 млн против 431,7 млн Т-клеток, недавно эмигрировавших из тимуса, в группе сравнения. Таким образом, нами получены свидетельства ослабления эмиграции Т-клеток из тимуса в периферический отдел иммунной системы у детей первого года жизни с тимомегалией. Эти изменения вызывают функциональный дефицит Т-клеточного звена иммунной системы и могут способствовать проявлению её несостоятельности, особенно в условиях повышенной нагрузки при воздействии патогенов. Поэтому детей с тимомегалией можно рассматривать как детей из группы риска, предрасположенных к более частым заболеваниям. Также следствием ослабления эмиграции Т-клеток из тимуса может быть недостаточная элиминация «ненужных» и «опасных» клонов тимоцитов (приводящая к повышению клеточности тимуса, т. е. тимомегалии) и снижение эмиграции зрелых Т-клеток (приводящее к Т-лимфопении).

Об авторах

П. Д Ваганов

ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

117997, г. Москва

М. Ф Никонова

ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

115478, г. Москва

Э. Ю Яновская

ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

117997, г. Москва

Э. Т Манджиева

ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

117997, г. Москва

Альмира Дмитриевна Донецкова

ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России; ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Email: almira_donetskova@yahoo.com
д-р мед. наук, вед. науч. сотр. лаборатории дифференцировки лимфоцитов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, Москва; доц. кафедры иммунологии ФГБОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, 117997, Москва 117997, г. Москва; 115478, г. Москва

Список литературы

Дополнительные файлы