THE RESULTS OF SCANNING ELECTRONIC MICROSCOPY OF ULTRA-THIN ENDOKERATOTRANSPLANT FORMED BY FEMTOSECOND LASER ON PART OF ENDOTHELIUM

Full Text

Эндотелиальная кератопластика (ЭК) в модификации DSEK (Descemet's stripping endothelial keratoplasty) в настоящее время является операцией первого выбора в лечении пациентов, страдающих патологией эндотелия и нуждающихся в трансплантации роговицы. Операция обеспечивает быструю зрительную реабилитацию, небольшой послеоперационный астигматизм и значительно снижает количество интра- и послеоперационных осложнений [1, 2]. Предложено множество способов формирования эндокератотрансплантата для DSEK: мануальная методика, техники с использованием микрокератома, фемтосекундного или эксимерного лазера [3-6]. Однако все методики, используемые для подготовки донорских трансплантатов, обеспечивают разное качество стромальной поверхности, что может оказывать влияние на послеоперационные функциональные результаты ЭК [2, 7]. Гладкость поверхности трансплантата является одним из наиболее важных параметров при оценке качества ламеллярного среза роговицы. Считается, что гладкая поверхность способна обеспечить оптически качественный интерфейс с наименьшим рубцеванием и образованием хейза, лучшую контрастную чувствительность с меньшим количеством оптических аберраций и в целом с лучшей остротой зрения [8-12]. Для оценки качества поверхности в условиях ex vivo общепринято использовать метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Степень шероховатости/гладкости получаемых изображений СЭМ определяется субъективно, как правило, несколькими независимыми исследователями [13-15] либо с использованием программного обеспечения [7, 13]. M.A. Terry и соавт. в своих исследованиях установили, что гладкость поверхности сформированного с помощью фемтосекундного лазера (ФЛ) Intralase трансплантата может быть сравнима с мануальной диссекцией [16]. Другие авторы высказывают предположение, что ФЛ создает более гладкую стромальную поверхность эндокератотрансплантата, чем при использовании микрокератома [17]. Многочисленные исследования различных авторов были направлены на поиски методов улучшения качества стромальной поверхности кератотрансплантата и, следовательно, интерфейса путём подбора и оптимизации параметров ФЛ [18, 21, 22]. Цель исследования: изучить качество стромальной и эндотелиальной поверхности эндокератотрансплантата, сформированного с помощью фемтосекундного (ФС) лазера со стороны эндотелия (инвертно). Материал и методы Клинические исследования выполнены на базе отдела травматологии и реконструктивной хирургии ФГБУ «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России. Исследование методом СЭМ выполнено на базе ФГБУН «Институт общей и неорганической химии им. Курнакова» РАН. Для формирования эндокератотрансплантата для задней кератопластики использовался ФЛ LDV Z6 («Ziemer», Швейцария). Для изучения влияния параметров лазерной фемтодиссекции, а также влияния вискоэластика на качество стромальной поверхности в ходе формирования трансплантата с эндотелиальной стороны и изучения эндотелиальной поверхности с помощью СЭМ проведены серии исследований поверхности стромы и эндотелия роговицы после фемтодиссекции. Для исследования использованы 6 пар глаз доноров, не пригодных для кератопластики. Анализ структуры образцов осуществляли на сканирующем электронном микроскопе Carl Zeiss NVision 40 с высоким разрешением, работающем при ускоряющем напряжении 1 кВ. Образцы не были покрыты проводящим слоем перед измерениями. Изображения были взяты с детектором Everhart-Thornley (SE2) в увеличениях 100-300. После стандартного выкраивания корнеосклеральных дисков из всех исследуемых глаз, роговицы пар № 1 и 2 подвергнуты фемтодиссекции с эндотелиальной стороны с параметрами 1: глубина 100 мкм, скорость реза вертикальных границ составила 7,5 мм/с, с мощностью 150%. Диссекция по строме производилась с мощность 90% и скоростью 7,5 мм/с, общее время диссекции составило 84 с. На эндотелий роговицы правых глаз перед фемтодиссекцией наносили когезивный вискоэластик Provisc («Alcon», США), на эндотелий левых глаз вискоэластик не наносился. Роговицы из пар № 3 и 4 подвергнуты фемтодиссекции с эндотелиальной стороны с параметрами 2: глубина 100 мкм, скорость диссекции вертикальных границ составила 8,0 мм/с, с мощностью 110%, диссекция по строме производилась со скоростью 5,0 мм/с и мощностью 100%, время диссекции заняло 72 с. На эндотелий роговицы правых глаз перед фемтодиссекцией наносили когезивный вискоэластик Provisc («Alcon», США), в то время как на эндотелий левых глаз вискоэластик не наносился. Роговицы из пар № 5 и 6 фемтодиссекции не подвергались. На эндотелий роговицы правых глаз наносили когезивный вискоэластик Provisc («Alcon», США) и далее осуществляли аппланацию фемторукоятки продолжительностью 80 с без лазерного воздействия. Интактный эндотелий роговицы левых глаз служил группой сравнения для роговиц правых глаз пар № 5 и 6. Для исследования отобраны остаточные корнеосклеральные диски пар № 1-4, а также цельные корнеосклеральные диски пар № 5 и 6. После фиксации в 2,5% растворе фосфатного буферного глютаральдегида образцы дегидратировали при 4°C последовательно в батарее водных растворов этанола возрастающей концентрации: 50, 75, 80, 90% и в абсолютном этаноле на заключительном этапе. На каждой стадии образцы дважды погружали на 5 мин в раствор этилового спирта. Для удаления спирта образцы переносили на 30 мин в гексаметилдисилазан (HMDS), после чего высушивали на воздухе. Подготовленные образцы монтировали на объектодержатель электронного микроскопа посредством токопроводящего клея. Анализ структуры образцов осуществляли на сканирующем электронном микроскопе Carl Zeiss NVision 40 с высоким разрешением, работающем при ускоряющем напряжении 1 кВ. Образцы не были покрыты проводящим слоем перед измерениями. Изображения взяты с детектором Everhart-Thornley (SE2) в увеличениях 100-300. Полученные изображения субъективно оценивали три независимых исследователя. Для градации качества стромальной поверхности нами предложена следующая шкала: 1 - очень гладкая, 2 - гладкая, 3 - шероховатая и 4 - очень грубая. Изображения были представлены исследователям в случайном порядке, без идентификации параметров фемтодиссекции. Результаты Изображение с самой грубой поверхностью и наиболее выраженным количеством гребней и складок получено с параметрами 1 и применением когезивного вискоэластика (рис. 1). Оценка по шкале равнялась 4 баллам. Изображение поверхности, полученное без использования вископротектора и с теми же параметрами ФЛ, оценено в 3 балла (рис. 2). Самая гладкая поверхность получена с параметрами 2, когда при фемторассечении вископротектор не использовался, этот снимок оценен по шкале 1 баллом (рис. 3). Изображение поверхности роговицы, полученной методом СЭМ с применением когезивного вискоэластика и параметрами 2, оценено в 2 балла (рис. 4). Снимок эндотелиальной поверхности без лазерного воздействия и протективного покрытия наглядно демонстрирует степень механического повреждения эндотелиальных клеток по сравнению с изображением интактного эндотелия, полученного методом СЭМ (рис. 5, 6). Обсуждение Впервые технологию фемтолазерной диссекции стромы роговицы in vitro использовали B. Seitz и соавт., которые продемонстрировали возможности фемтосекундного лазера Femtec (20/10 Perfect Vision, Германия) с частотой импульсов 12,5 кГц, уровнем энергии 10 мкДж и глубиной рассечения 500 мкм для формирования эндотелиального трансплантата диаметром 6-7 мм. По данным исследователей, данные СЭМ показали гладкую стромальную поверхность трансплантата, а коллагеновые волокна визуализировались без признаков термического повреждения [23]. M.A. Terry и соавт. установили, что гладкость поверхности сформированного трансплантата с помощью ФС-лазера Intralase может быть сравнима с таковой при мануальной диссекции [24]. Есть данные, свидетельствующие о том, что качество поверхности трансплантата при его фемтолазерном формировании зависит от глубины стромальной диссекции [19, 20]. Это объясняется тем, что передние слои роговицы имеют большее количество тканевых сшивок между волокнами, обеспечивая достаточную плотность ткани. Однако в более глубоких слоях эти отношения неполноценны, коллагеновые волокна имеют свободную, рыхлую конфигурацию, в связи с чем при фемтодиссекции происходит рассеивание и ослабление лазерной энергии, что может привести к образованию гребней, складок и хейза различной интенсивности [25-27]. С. Zhang и соавт. опытным путём определили оптимальную глубину фемтодиссекции роговицы на платформе лазера Intralase FS 60 кГц, на которой отмечается наиболее гладкая поверхность интерфейса с минимальным количеством гребней и складок, она составляет 31% от общей толщины роговицы, что соответствует в среднем 160-200 мкм [28]. Ранее нами была показана возможность использования установки LDVZ6 в клинике и представлены среднесрочные результаты операций [29]. В данной работе, по нашим сведениям, впервые представлены результаты СЭМ стромальной и эндотелиальной поверхности эндокератотрансплантата, сформированного инвертным способом установкой LDVZ6. С помощью СЭМ нами изучено влияние параметров ФЛ и присутствие вископротектора на качество поверхности трансплантата, сформированного с эндотелиальной стороны. В ходе работы установлено, что использование вискоэластика в момент процедуры фемтодиссекции негативно сказывается на качестве интерфейса. Согласно изображениям, полученным методом СЭМ, на поверхности трансплантата можно наблюдать множество складок, неровностей и гребней. Подобные образования в значительной степени могут влиять на функциональные результаты ЭК. Фемтодиссекция без применения каких-либо протективных покрытий позволяет получить очень гладкую стромальную поверхность, однако подобная процедура достаточно травматична для эндотелиального слоя роговицы. Однако в литературе встречается иное мнение, согласно которому при выкраивании трансплантата фемтосекундным лазером с эндотелиальной стороны клинически значимой потери плотности эндотелиальных клеток не происходит и она составляет 6-14% [30]. В поисках методов улучшения качества интерфейса общее мнение сводится к тому, что низкая энергия лазера [18, 21] и применение растрового паттерна [22] производят наиболее гладкий и ровный интерфейс при фемторассечении роговицы на глубине от 200-500 мкм. Однако даже с оптимизацией лазерных параметров при фемторассечении роговицы в глубоких слоях стромальная поверхность трансплантата имеет гребни и шероховатости, которые могут быть причиной неудовлетворительных зрительных результатов. Заключение Присутствие вискоэластика ухудшает качество стромальной поверхности при ФЛ- формировании эндокератотрансплантата со стороны эндотелия, в то время как его отсутствие негативно сказывается на плотности эндотелиальных клеток.

About the authors

Oganes G. Oganesyan

The Helmholtz Moscow research institute of eyes diseases

Email: oftalmolog@mail.ru
doctor of medical sciences, leading researcher of the department of traumotology and reconstructive surgery of the Helmholtz Moscow research institute of eyes diseases, 105062, Moscow 105062, Moscow, Russian Federation

S. S Yakovleva

The Helmholtz Moscow research institute of eyes diseases

105062, Moscow, Russian Federation

A. E Baranchikov

The N.S. Kurnakov institute of general and inorganic chemistry

119991, Moscow, Russian Federation

V. K Ivanov

The N.S. Kurnakov institute of general and inorganic chemistry

119991, Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files