EVALUATION OF BONE TISSUE REGENERATION USING A COMBINATION OF AUTOLOGOUS FIBRIN MATRIX WITH PRE-DIFFERENTIATED MESENCHYMAL STEM CELLS IN AN EXPERIMENTAL MODEL

Full Text

Введение Первое место среди повреждений костей лицевого скелета занимают переломы нижней челюсти. Отечественными и зарубежными авторами показано, что частота повреждения нижней челюсти колеблется от 36-84% от общего числа повреждений костей лицевого скелета, в том числе с образованием дефекта костной ткани [1-3]. В последние десятилетия активно развивается направление тканевой инженерии для восстановления поврежденных зон организма в различных его локациях. С момента открытия А.Я. Фриденштейном мезенхимально стволовых клеток (МСК) их анализ, виды, методики выделения и применения в различных комбинациях с материалами позволили расширить границы регенеративной медицины. Тенденции регенеративной медицины в восстановление костной ткани, сосредоточены на плюрипотентных мезенхимально стволовых клетках жирового происхождения (жМСК), так как произвести забор небольшого количества жировой ткани значительно легче, нежели такие же объемы костного мозга, а также стоит отметить, что общее количество МСК в костном мозге не превышает 0,01% и имеет тенденцию к уменьшению со временем старения организма [4]. Проводя анализ литературы, мы обратили внимание на то, что многие авторы проводили свои экспериментальные работы по внедрению жМСК на своде черепа, где имеется твердая мозговая оболочка с ярко выраженным кровоснабжением, что, по нашему мнению, нарушает интерпретацию результатов, поэтому при создании экспериментальной модели мы решили использовать область угла нижней челюсти, где толщина костного слоя имеет минимальный компактный слой, что затрудняет процессы регенерации [5]. Целью нашего исследования являлась оценка регенераторного потенциала кортикальной костной ткани в области угла нижней челюсти при внесении экзогенных предифференцированных МСК (пМСК) на аутологичном фибриновом матриксе в эксперименте [6]. Материал и методы Экспериментальное исследование было проведено на 27 кроликах породы Советская шиншилла в возрасте 1 года (±1 мес) массой от 5 до 7 кг. Все животные содержались в виварии в условиях, соответствующих международному стандарту. Работы с животными проводились в строгом соответствии с законодательством Российской̆ Федерации, Положениями директивы 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях (Статья 27), а также требованиями и рекомендациями «Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных» [7]. Животные были разделены на 3 группы. Контрольную группу составили 9 животных. У данной группы животных в сформированный дефект костной ткани заполнялся кровяным сгустком. Основную группу (А и Б) составили 18 животных, разделенных на 2 группы по 9 особей. Животным группы А в сформированный дефект нижней челюсти вводили аутологичный фибриновый сгусток с предифференцированными МСК в количестве 300 тыс клеток. Животным группы Б в сформированный дефект нижней челюсти вводили аутологичный фибриновый сгусток с предифференцированными МСК в количестве 1 млн клеток. Вывод животных из экспериментального исследования производился на 8, 10, 12 неделе по 3 животных из каждой группы. Получение жировой ткани от лабораторных животных проводилось по разработанному нами хирургическому протоколу. Полученную в ходе первого хирургического этапа жировую ткань подвергали мелкой сепарации в чашки Петри и растворе PBS (Phosphate buffered saline - фосфатный буферный раствор) (Sigma Aldrich), обрабатывали 0,075% раствором коллагеназы (Sigma Aldrich) и трипсина, и оставляли в инкубаторе на 40 мин. Для инактивации комбинации трипсина и коллагеназы, полученный раствор разводили трехкратным раствором PBS (Sigma Aldrich), и центрифугировали при 500g 15 мин. Полученный супернатант аспирировался и добавлялся в ростовую среду, содержащую DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) (Sigma Aldrich) 10% фетальную телячью сыворотку, и 1% пенициллин/стрептомицин. Замену ростовой среды производили каждые 3-4 дня. Через неделю инкубационного периода, производили количественную оценку колонии МСК путем окрашивания трипаново-синим, а также проводили автоматический расчет жизнеспособных клеток колонии. По достижению конфлюэнтного монослоя, рассаживали клетки в 4 флакона с стандартной ростовой средой и вносили в каждый флакон по 10×104 клеток. Для остеогенной дифференцировки линейки МСК в полученную колонию МСК вводили остеогенную среду, содержащую 10 ммоль/л β-glycerophosphate, 0,1 ммоль/л dexamethasone, и 50 ммоль/л L-ascorbic acid (Sigma Aldrich). Инкубировали клетки на протяжении 28 дней со снятием контрольной группы клеток каждые 7, 14, 21 сут. По достижению пМСК конфлюента, экспериментальные животные готовились ко второму хирургическому вмешательству. За сутки до оперативного вмешательства у каждого кролика производили забор крови из поверхностной ушной вены в объеме 30 мл в пробирки фирмы Vacuette (ISO 6710). Центрифугировали полученную кровь при значениях 2600 rpm на 12 мин для получения аутологичной фибриновой матрицы. В полученные фибриновые сгустки вводили пМСК и помещали в ростовую среду в инкубатор на сутки. Для подтверждения остеогенной дифференцировки клеток производилась полимеразно-цепная реакция,для определения уровня RUNX. Реакция проводилась до смены ростового раствора на остеогенную среду, далее на 7, 14 и 21-е сутки, после замены ростовой среды. Перед вторым хирургическим этапом животным проводилась премедикация 2% раствором ксилазина гидрохлорида (ксила) в дозе 5 мг/кг. Для общей анестезии применяли внутримышечное введение 5% раствора тилетамина гидрохлорида и золазепама гидрохлорида (золетил) в дозе 15 мг/кг, в/м, но не более 0,25 мл в точку введения. После введения исследуемого животного в состояние наркоза, удаляли шерсть в области угла, обрабатывали кожные покровы раствором антисептика (3% раствор перекиси водорода) и производили послойное рассечение мягких тканей до кости, отслаивая прикрепленную жевательную мышцу. Трепаном формировали дефект костной ткани в области угла нижней челюсти диаметром 6 мм. В постоперационном периоде экспериментальным животным проводилась анальгезирующая и антибактериальная терапия, аналогичная первому хирургическому этапу. Радиографическое исследование: кроликам проводилась компьютерная томография на аппарате Versan на 8, 10 и 12-й неделе соответственно после выведения из эксперимента. Животные выводились из эксперимента путем погружения в СО2 камеру. Данные компьютерной томографии подвергались обработке в программе Osirix Lite. Полученные данные подвергались обработке в программе Statistica for windows. График построен с применением Microsoft Еxcel. Для оценки различий между двумя независимыми выборками применялся статистический критерий Манна-Уитни с расчетами изменений объема дефекта на 8,10,12 неделе между контрольной группой и получавшим лечение (рис. 1). Результаты При проведении анализа данных КТ мы выяснили, что через 8 недель после начала экспериментального исследования в контрольной группе костный дефект в области угла нижней челюсти имеет овальную форму, отчетливо прослеживается тенденция к увеличению размеров дефекта, присутствуют явления резорбции по краям дефекта без признаков костеобразования со средним значением объема дефекта по группе 0,034467 ± 0,0071685 мм3. В группе, где был использован аутологичный фибриновый матрикс с 300 тыс клеток пМСК, дефект имеет овальную форму, отмечается уменьшение размеров дефекта со средним значением по группе 0,014311 ± 0,00426 мм3. В группе Б, где был использован аутологичный фибриновый матрикс с 1 млн клеток, на 8-й неделе нет сильно выраженного отличия при сравнении с группой А со средним значением 0,015889 ± 0,00342 мм3. На 10 неделе лечения, отчетливо прослеживается изменения по заполнению дефекта костной тканью между контрольной группой и группой, получавшей лечение со средними значениями по группам: ◆контрольная группа - 0,048444 ± 0,00031426 мм3; ◆группа А - 0,01269 ± 0,00228 мм3; ◆группа Б - 0,01526 ± 0,00275 мм3. На 12-й неделе после оперативного вмешательства в экспериментальной группе Б размер дефекта костной ткани значительно сократился и составил 0,006022 ± 0,00135 мм3 (рис. 2), в то время как в контрольной группе объем дефекта составил 0,05597 ± 0,00505 мм3 (рис. 3), а в группе А - 0,02235 ± 0,0056 мм3 (рис. 4). Заключение В экспериментальном исследовании было получено улучшение патофизиологических процессов регенерации костной ткани, в условиях бикортикального дефекта, с минимальным присутствием губчатого вещества в зоне повреждения. Первые результаты исследования, свидетельствуют о том, что трансплантация аутогенного фибринового композита с предифференцированным МСК, позволяет позитивно влиять на регенеративный потенциал окружающих тканей, снижая недостаток нутриентов и кислорода в зоне повреждения, и обеспечивая ускоренное восстановление от периферии к центру. Совместное применение высоких концентраций МСК с аутологичной фибриновой матрицей позволяет уменьшить краевую резорбцию в зоне повреждения. Так в основной группе животных, где использовались МСК, краевой резорбции не наблюдалось. Вероятно, это связано с более высокими концентрациями преостеобластов, ростовых факторов, сигнальных молекул и цитокинов, которые были привнесены из вне, а также отмечено уменьшение размеров объема костного дефекта в экспериментальной группе на 10-й неделе в 3,8 раз по сравнению с контрольной и 9,3 раза на 12-й неделе.

About the authors

Igor S. Kopetsky

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

Email: kopetski@rambler.ru
doctor of medical sciences, head of the Department of therapeutic Stomatology “N.I. Pirogov Russian National Medical University”, 117997, Moscow, Russian Federation 117997, Moscow, Russian Federation

V. V Loginov

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

117997, Moscow, Russian Federation

S. D Ryzhova

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

117997, Moscow, Russian Federation

P. S Virgilyev

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

117997, Moscow, Russian Federation

A. V Lokhonina

V.I. Kulakov National Medical Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology

117997, Moscow, Russian Federation

S. V Kostyrev

N.A. Lopatkin Scientific Research Institute of Urology and Interventional Radiology - branch of the National Medical Research Radiologiсal Center

105425, Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files