EFFECT OF AMINOGUANIDINE ON CATARACTOGENESIS IN EXPERIMENTAL DIABETES MELLITUS

Full Text

Aктуальность исследования Катаракта является основной причиной нарушения зрения у больных сахарным диабетом [1-3]. Согласно литературным данным продолжительность диабета и качество гликемического контроля влияют на вероятность развития катаракты [4, 5]. В настоящее время описываются возможные пути катарактогенеза. В частности, есть данные о влияние оксидативного стресса [6, 7], накопления сорбитола в хрусталике в результате активации полиольного пути обмена глюкозы [8, 9], а также неферментативного гликирования белков хрусталика, приводящего к образованию диабетической катаракты [10, 11]. Хрусталик представляет собой достаточно закрытую систему, лишенную сосудов, имеющую ограниченные возможности для регенерации. Белки достигают 35% массы хрусталика и более 85% его сухого остатка, а их особое физико-химическое состояние во многом определяет его прозрачность. Белки хрусталика относятся к долгоживущим и являются уязвимыми для неферментативного гликирования, которое является, по сути, посттрансляционной модификацией высокомолекулярной структуры белка. В такой зоне лимитированного белкового обмена степень гликирования белков может повышаться в 10 раз [12]. Развитие катаракты характеризуется увеличением зон светорассеяния, которые появляются при дезорганизации хрусталиковых волокон. Неферментативное гликирование вызывает формирование поперечных сшивок (кросслинкинг) в высокомолекулярной структуре белка, что вызывает их конформационное преобразование [13, 14], агрегацию молекул [15], потерю ими растворимости [16] и, в конечном счете, окрашивание и снижение прозрачности хрусталика [17], поскольку конечные продукты гликирования (КПГ) выступают в роли фотосенсибилизаторов [18, 19]. В эксперименте [20] КПГ приводили к снижению конформационной стабильности гамма-кристаллина - одной из фракций водорастворимых хрусталиковых белков. В работе [21] показано, что гликирование альфа-кристаллина приводило к потере им шапероноподобной активности, повышению образования карбоксиметиллизина (КМЛ) и увеличению флуоресценции КПГ. При сахарном диабете повышается концентрация КПГ как в хрусталике [17, 22], так и во влаге передней камеры глаза [23], что позволяет рассматривать их как предиктор развития катаракты и диабетической ретинопатии [24]. Карбоксиметилллизин (КМЛ) является одним из основных продуктов неферментативного гликирования [25, 26], к тому же единственным из КПГ, который выступает лигандом для рецепторов КПГ (RAGEs). Связывание КПГ с RAGEs приводит к увеличению генерации свободных радикалов, активации ядерного фактора Nf-kB и повышению уровня медиаторов воспаления. КМЛ согласно некоторым источникам является основным КПГ, определяемом в хрусталике [27, 28]. Примером реакции неферментативного гликирования является реакция Майяра [29, 30]. Ингибирование ее на каком-либо этапе должно вызывать торможение катарактогенеза [31, 32]. Аминогуанидин чаще других используют в качестве эталонного антигликирующего агента в эксперименте [11, 33, 34]. Аминогуанидин является гидразиноподобной молекулой, проявляющей антигликирующее действие. Он действует не только на образование КПГ, но и посредством основной активности влияет на иные, связанные звенья патогенеза (активность протеинкиназы С, NFκ-B, зависящие от уровня КПГ и др.). Действие будет носить множественный характер, поскольку патогенетическая роль КПГ множественна. В условиях эксперимента аминогуанидин устранял микроальбуминурию, ассоциированную с СД, при этом нормализуя уровень активности гломерулярной протеинкиназы С [35]. Согласно одним литературным данным аминогуанидин вызывает задержку развития катаракты у диабетических животных [36, 38], другим - не оказывает на этот процесс никакого влияния [11, 39]. Препарат снижал воспаление нервной ткани при болезни Альцгеймера, при этом подавляя активность NFκ-B [40]. При этом неизменно активность аминогуанидина сопровождается подавлением образования КПГ в условиях in vivo и in vitro. Существует множество возможных механизмов действия в предотвращении формирования КПГ, среди которых хелатирование металлов переходного ряда, антиоксидантное действие, связывание карбонильных интермедиатов и др. Ряд активностей могут быть взаимозависимы друг с другом, и могут определяться общими структурными элементами молекулы, значимыми для каждой из активностей или более тонкими квантово-химическими характеристиками [41, 42]. Среди КПГ-ассоциированных механизмов действия препарата рассматривались: 1) ингибирование продуктов Амадори; 2) связывание реактивных карбонильных соединений, 3) ингибирование семикарбазид-чувствительной аминооксидазы (SSAO) - фермента продуцента метилглиоксаля [43]. Наиболее устоявшийся взгляд на активность аминогуанидина предполагает, что он связывает дикарбонильные соединения (глиоксаль, метилглиоксаль и 3-дезоксиглюкозон), образующиеся как промежуточный продукт в реакции гликирования. Относительно селективная блокада iNO-синтазы аминогуанидином играет роль в предупреждении сосудистых осложнений сахарного диабета. Учитывая вышесказанное, является перспективным поиск среди антигликирующих соединений потенциальных антикатарактальных агентов. Целью данного исследования является изучение образования помутнения хрусталиков у крыс при стрептозотоцин - индуцированном сахарном диабете и оценить влияние на этот процесс аминогуанидина. Материал и методы Эксперименты проведены на половозрелых крысах-самцах линии Sprague Dawley, доставленных из ООО «НПК БиоТех» (Москва) и прошедших 2-х недельный карантин в виварии ВолгГМУ. Содержание животных и проведение экспериментов соответствовало «Принципам надлежащей лабораторной практики» (ГОСТ Р-53434-2009) и рекомендациям «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств». В группу контроля вошли интактные лабораторные животные. У остальных вызывали сахарный диабет стрептозотоцином, растворенным в 0,1М натрий-цитратном буфере (рН 4,5), который вводили в хвостовую вену в дозе 45 мг/кг. Из эксперимента исключались животные с уровнем гликемии менее 15 ммоль/л. Крысы со стрептозотоцин-индуцированным диабетом были разделены на две группы: группу контроля сахарного диабета (СД) и опытную группу СД с животными, которые получали внутрижелудочно аминогуанидин в дозе 50 мг/кг, начиная с 7 дня после введения стрептозотоцина в течение последующих 3 мес. Для прижизненного исследования хрусталиков глаз лабораторных животных проводили офтальмоскопию в режиме ретроиллюминации на портативной щелевой лампой Digital hand-held slitl amp (США) с фоторегистрацией изображения в условиях медикаментозного мидриаза, вызываемого закапыванием 1% раствором тропикамида, в начале и в конце эксперимента. Для оценки степени помутнения хрусталиков использовали модифицированную классификацию Suryanarayana et al. [44, 45]: ◆0 - прозрачный хрусталик; ◆1 - минимальная непрозрачность в центре хрусталика (наличие небольшого количества субкапсулярных вакуолей); ◆2 - очаговые помутнения в центре и по периферии хрусталика («туманное» помутнение коры); ◆3 - помутнение всего хрусталика (плотное помутнение ядра и «туманное» помутнение коры); ◆4 - зрелая катаракта - плотное помутнение коры и ядра хрусталика. Также дополнительно проводилось измерение внутриглазного давления (ВГД) с помощью офтальмологического ветеринарного тонометра Tonovet (Финляндия), не требующего предварительной анестезии роговицы. Следует подчеркнуть, что согласно зарубежным литературным данным, влияние аминогуанидина на уровень ВГД отсутствует или является незначительным [46-48]. После эвтаназии лабораторных животных (400 мг/кг хлоралгидрата внутрибрюшинно) глазные яблоки были энуклеированы. Одно глазное яблоко каждого лабораторного животного подвергалось патоморфологическому исследованию, из другого выделялся хрусталик для определения содержания в нем КПГ и КМЛ. Для фиксации глазного яблока использовали свежеприготовленный модифицированный раствор Давидсона [49]. Далее материал обезвоживали в батарее спиртов восходящей крепости и заключали в парафиновую среду Histomix. С полученных блоков на микротоме получали срезы толщиной 4-6 мкм и монтировали их на предметные стекла. Срезы окрашивали гематоксилином и эозин-флоксином по стандартной методике [50]. Микропрепараты изучали и фотографировали на микроскопе AxioScope A1, оборудованной цифровой камерой AxioCam MRc5. Для оценки степени катаракты использовали бальную систему от 0 до 5 (Смирнов А.В., Великородная Ю.И.): ◆0 - признаки катаракты отсутствуют; ◆0,5-1 - начальные признаки субкапсулярной или кортикальной катаракты, проявляющиеся вакуолизацией и набуханием волокон хрусталика. ◆1,5-2 - локальные проявления катаракты, выражающиеся в гиперплазии эпителиальных клеток под капсулой (субкапсулярная) или набуханием волокон хрусталика (кортикальная). ◆2,5-3 - выраженная кортикальная катаракта с дефрагментацией и набуханием волокон, образование морганиевых телец. ◆3,5-4 - кортикальная катаракта охватывает весь хрусталик (дефрагментация и набухание волокон, наличие «баллонных клеток», морганиевых телец по всему периметру хрусталика). ◆4,5-5 - ядерная катаракта (гиалиноз). Определение содержания КПГ и КМЛ в хрусталиках проводили в соответствии с методом [51]. Количество КПГ и КМЛ в супернатантах измеряли иммуноферментным методом с помощью коммерческого набора «ELISA Kitfor Advanced glycation endproducts» (Cloud Clone, Китай) в соответствии с инструкцией производителя на многофункциональном микропланшетном ридере Infinite M200 PRO (Tecan, Австрия). Полученные результаты статистически обрабатывали с помощью программы Microsoft Excel 2016 (США). Проводился расчет базовых статистических показателей, характеризующих вариационные ряды (среднее арифметическое значение M, стандартная ошибка средней арифметической m). Достоверность результатов офтальмоскопии оценивали по критерию Манна-Уитни, достоверность данных офтальмотонометрии, иммуноферментного анализа и патоморфологического исследования - по t-критерию Стьюдента. Результаты Уровень глюкозы в крови у лабораторных животных уже на третий день после введения стрептозотоцина достоверно превосходил этот показатель у интактных крыс. В течение всего эксперимента уровень глюкозы в крови крыс с СД оставался достоверно высоким, превосходя значения интактной группы животных (в 4,5 раз - в 1 месяц, в 5,6 раз - во 2 месяце и в 5,1 раз - в третьем месяце). В группе животных, получавших аминогуанидин, уровень глюкозы на протяжении эксперимента также оставался достоверно высоким по сравнению с группой интактного контроля (в 4,5 раза - в 1 месяц, в 4,4 раза - во 2 месяце и в 4,4 раза - в третьем месяце). Таким образом, аминогуанидин не оказывал влияния на уровень глюкозы в крови, и данный показатель был сопоставим в обеих группах животных с СД. Развитие диабета у крыс сопровождалось потерей веса, у них развивались полиурия, полидипсия, полифагия - клинические признаки характерные для тяжелой формы СД. Животные были вялыми и апатичными. Данные об абсолютном количестве животных, принимавших участие в эксперименте, их смертности и развитии СД представлены в табл. 1. Проведенная офтальмоскопия в режиме ретроиллюминации показала, что у интактных животных хрусталики оставались прозрачными до конца эксперимента. В группе контроля СД развивалась 2 стадия помутнения хрусталиков. У крыс, получавших аминогуанидин, результаты были достоверно лучше, так как развивалась только 1 стадия помутнения хрусталиков (табл. 2). По данным патоморфологического исследования у интактных животных за 3 мес эксперимента не появлялись признаки развития катаракты, а при СД запускался активный катарактогенез. У всех крыс из группы контроля СД была выявлена катаракта различной степени выраженности (табл. 3) с вовлечением в патологический процесс передней части хрусталика в виде дефрагментации и набухания волокон по периферии хрусталика, миграции переднего эпителия к полюсам и на заднюю поверхность хрусталика, образования морганиевых телец. В хрусталиках у животных, которым вводился аминогуанидин, преобладали начальные признаки субкапсулярной или кортикальной катаракты с вакуолизацией и набуханием волокон хрусталика, в единичных случаях с дефрагментацией и набуханием волокон по периферии хрусталика, миграцией переднего эпителия к полюсам хрусталика (см. рисунок на 3-й странице обложки). Как видно из представленных данных, результаты офтальмоскопического контроля в целом согласуются с патоморфологической картиной. При выраженной гипергликемии запускается катарактогенез, но на фоне применения антигликирующего соединения наблюдается меньшая степень помутнения хрусталика. Также было выявлено, что у крыс с СД повышается ВГД по сравнению с интактными животными: на 28% - в группе контроля СД и на 16% - в группе животных, получавших аминогуанидин (табл. 4). Эти результаты представляются интересными, и в дальнейшем требуется экспериментальное изучение системно введенного аминогуанидина на уровень ВГД. По результатам иммуноферментного анализа в группе контроля СД отмечалось 2-кратное увеличение содержания КПГ в хрусталиках крыс по сравнению с этими показателями у интактных животных. В группе животных, получавших аминогуанидин, наблюдалась противоположная тенденция: содержание КПГ в хрусталиках крыс из данной группы снижалось до уровня, статистически не отличающегося от значений группы интактного контроля. Повышение содержания КМЛ в хрусталиках животных с сахарным диабетом было менее выраженным. При этом на фоне введения аминогуанидина у крыс отмечалось статистически значимое снижение данного показателя (табл. 5). Обсуждение Гипергликемия при сахарном диабете повышает степень гликирования хрусталиковых белков. Учитывая, что хрусталик, в принципе, является белковым образованием, а его прозрачность зависит от состояния высокомолекулярных белковых структур в его составе, то нарушение их правильной организации в связи с накоплением КПГ при СД, неизбежно приводит к потери им оптической функции, запуская катарактогенез. Аминогуанидин, как антигликирующий агент, препятствует образованию КПГ из хрусталиковых белков при СД. Об этом свидетельствует снижение накопления КПГ и, в частности, КМЛ в хрусталиках у крыс, которым вводился аминогуанидин в рамках эксперимента по сравнению с животными из группы контроля СД. Снижение образования КПГ, в свою очередь, вызывает отсроченное развитие помутнения хрусталиков на фоне применения аминогуанидина, что подтверждается данными офтальмоскопического контроля и патоморфологического исследования. В связи с этим аминогуанидин, помимо широко описанной в литературе антигликирующей активности [36-38, 52, 53] также обладает антикатарактальным эффектом в условиях экспериментального сахарного диабета. Такие выводы вполне согласуются с данными литературных источников [36-38] и укладываются в описанный выше патогенетический путь образования катаракты при сахарном диабете. Вместе с тем следует подчеркнуть, что катаракта является мультифакторным заболеванием, а неферментативное гликирование служит одним из основных механизмов катарактогенеза, но далеко не единственным [52, 54]. Этим предположительно объясняется развитие помутнений хрусталиков у животных со стрептозотоцин-индуцированным диабетом на фоне введения аминогуанидина, хоть и в меньшей степени, чем у крыс из контрольной группы СД. Вероятно, новые соединения, превосходящие по антигликирующему действию аминогуанидин, будут обладать более выраженным антикатарактальным эффектом. Предполагаемый механизм антикатарактального действия аминогуанидина при СД, связанный с его антигликирующими свойствами, безусловно, является перспективным для дальнейшего направленного поиска средств профилактики и терапии катаракты. Изучение новых антигликирующих соединений, потенциальных антикатарактальных агентов, в свете литературных научных данных и результатов этого эксперимента, в настоящее время является обоснованным. Заключение Среди глазных осложнений сахарного диабета катаракта занимает лидирующие позиции и неизменно приводит к раннему снижению остроты зрения. Дезорганизация хрусталиковых волокон, отчасти ассоциированная с накоплением КПГ как результатом реакции неферментативного гликирования, приводит к образованию зон светорассеяния и диффузному снижению прозрачности хрусталиков, что говорит об активном катарактогенезе. В ходе эксперимента у лабораторных животных наблюдались нарушения структуры и функции глаза, вызванные развитием СД 1 типа: было выявлено формирование катаракты различной степени, а также повышение уровня ВГД. В свою очередь аминогуанидин, связывающий дикарбонильные интермедиаты в реакциях их превращения в КПГ, по результатам данного исследования, тормозит образование помутнения в хрусталиках при стрептозотоцин-индуцированном сахарном диабете, снижает выраженность морфологических признаков патологии хрусталика, а также уменьшает содержание в них основного КПГ - КМЛ.

About the authors

A. A Spasov

Volgograd State Medical University

400131, Volgograd, Russian Federation

Yulia A. Govorova

Volgograd State Medical University

Email: j.govorova@yandex.ru
applicant for the Department of Pharmacology and Bioinformatics, Volgograd State Medical University, 400131, Volgograd, Russian Federation 400131, Volgograd, Russian Federation

L. V Naumehko

Volgograd State Medical University

400131, Volgograd, Russian Federation

D. A Babkov

Volgograd State Medical University

400131, Volgograd, Russian Federation

A. S Taran

Volgograd State Medical University

400131, Volgograd, Russian Federation

A. B Smirnov

Volgograd State Medical University

400131, Volgograd, Russian Federation

Yu. I Velikorodnaya

Volgograd State Medical University

400131, Volgograd, Russian Federation

References

Supplementary files