THE DECREASE OF EMIGRATION OF T-LYMPHOCYTES FROM THYMUS UNDER THYMOMEGALIA IN CHILDREN OF EARLY AGE

Full Text

Термином «тимомегалия» принято обозначать увеличение объема и массы тимуса выше предельных возрастных значений с сохранением нормальной гистоархитектоники органа [5, 7]. Тимомегалия чаще всего определяется у детей раннего возраста. При тимомегалии наблюдаются признаки гипофункции Т-клеточного звена иммунной системы — снижение численности Т-лимфоцитов, изменение их субпопуля-ционного состава, ослабление функциональной активности [1, 4, 6, 8, 9]. Характерным для этого состояния является снижение сывороточного уровня гормонов тимуса [4], свидетельствующее об ослаблении эндокринной функции тимуса. Увеличение численности лимфоидных клеток тимуса (тимоцитов), характерное для тимомегалии, может быть результатом снижения интенсивности апоптоза, реализуемого в ходе селекции тимоцитов, или ослабления эмиграции зрелых Т-лимфоцитов из органа в периферический отдел иммунной системы. Прижизненная оценка интенсивности апоптоза внутри тимуса представляется затруднительной. В то же время существует метод определения уровня эмиграции Т-клеток по содержанию в Т-клетках крови Т-рецепторных эксцизионных колец (ТРЭК). ТРЭК представляют собой кольцевидные структуры, образованные ДНК, которые локализуются в составе эписом в цитоплазме клеток. Они образуются в ходе перестройки генов Т-клеточного рецептора, реализуемой при дифференцировке Т-лимфоцитов в тимусе [10]. В периферической крови ТРЭК определяются только в так называемых недавних мигрантах из тимуса (RTE — Recent thymic еmigrants) — Т-клетках, которые не пролиферировали после выхода из тимуса на периферию [12]. Поскольку при делении клеток эписомальная ДНК не подвергается репликации, пролиферативный процесс приводит к снижению числа ТРЭК-содержащих Т-клеток. В связи с вышесказанным уровень таких клеток в кровотоке рассматривается как показатель интенсивности процессов Т-лимфопоэза и эмиграции Т-клеток из тимуса [3, 12, 13]. Цель данной работы состояла в оценке функции тимуса путем определения уровня ТРЭК в популяции Т-лимфоцитов периферической крови у детей с тимомегалией. Содержание ТРЭК определяли у 8 детей с тимо-мегалией. Возраст семи детей составлял от 6 мес до 2 лет и лишь одному ребенку было 5 лет. У всех детей был диагностирован острый бронхит — простой или обструктивный. Число ТРЭК определяли также у 19 детей без тимомегалии, из которых 10 детей в возрасте от 1 года до 5 лет c бронхитами или ОРВИ составили группу сравнения для группы детей с тимомегалией и 9 детей в возрасте от 6 до 16 лет обследовались для оценки возрастной динамики числа ТРЭК. Характеристика численности Т-клеток, их субпопуляционного состава и функциональной активности осуществлена на основе обследования 70 детей с тимомегалией и 26 детей из группы сравнения без тимомегалии. Размер тимуса определяли рентгенологически. Мерой выраженности тимомегалии был кардио-тимико-торакальный индекс ( КТТИ), который рассчитывали как отношение ширины тимуса к ширине грудной клетки на уровне куполов диафрагмы. Из периферической крови обследованных детей выделяли мононуклеарную фракцию путем центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности фиколла-гипака (Sigma, США) плотностью 1,077 г/мл по методу А. Boyum. Численность и субпопуляционный состав Т-лимфоцитов оценивали методом проточной цитометрии на цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Для определения Т-клеток использовали моноклональные антитела к CD3, Т-хелперы выявляли по окрашиванию комбинацией моноклональных антител к CD3 и CD4, цитотоксические Т-клетки — с использованием антител к CD3 и CD8, регуляторные Т-клетки — антител к CD4 и CD25 (учитывали клетки с высоким уровнем экспрессии CD25). В работе использовали моноклональные антитела фирм Becton Dickinson, США (анти-CD25, меченные фикоэритрином) и “Сорбент”, Москва (анти-CD3, анти-CD4, и анти-CD8, меченные флюоресцеинизотиоцианатом или фи-коэритрином). Для оценки пролиферации лимфоцитов в культуру мононуклеаров крови (0,5 х 106/мл среды) вносили фитогемагглютинин в конечной концентрации 10 мкг/мл и культивировали в течение 72 ч. За 18 ч до завершения культивирования в лунки вносили 40 кБк 3Н-тимидина и оценивали включение тимидина на счетчике β-сцинтилляций. Методы детально описаны в публикации [8]. Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы «Проба НК» («ДНК-Технология»). Метод основан на лизисе образцов в 4М растворе гуани-динтиоцианата, осаждении нуклеиновых кислот изопропанолом с последующими отмывками этанолом и ацетоном, подсушиванием и растворением в специальном буфере. Выделение ДНК проводили из 1 · 106 клеток. Объем полученной ДНК составил 25 мкл. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически, соотношение A260/280 составляло 1,6—2,0. Для постановки ПЦР использовали набор реагентов TaqMan Universal PCR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosystems). Для определения ТРЭК использованы следующие праймеры: прямой 5’-CGT GAG AAC GGT GAA TGA AGA GCA GAC A-3’, обратный 5’-CAT CCC TTT CAA CCA TGC TGA CAC CTC T-3’, а также флюоресцентно-меченный олигонуклеотид (зонд) 5’-FAM-TTT TTG TAA AGG TGC CCA CTC CTG TGC ACG GTG A-MGB-3’ [11]. Количество копий ТРЭК рассчитывали с использованием стандартной кривой, полученной по разведениям плазмиды с известной концентрацией ДНК ТРЭК. Результаты выражали числом копий ТРЭК на 1 мкг ДНК. Для определения количества геномной ДНК использован β-актин (Applied Biosystems). Амплификацию проводили на приборе 7300 Applied Biosystems Real-time PCR System. Реакцию ставили в объеме 25 мкл (в реакцию брали 100 нг ДНК) Таблица 1 Численность Т-клеток и их субпопуляций в составе мононуклеаров крови и ответ Т-клеток на действие митогена у детей с тимомегалией в сопоставлении с контрольной группой соответствующего возраста Показатель Группа сравнения Тимомегалия CD3+ клетки % 79,8 ± 9,0 71,0 ± 12,1* 109/л 4,59 ± 0,93 3,19 ± 1,25* CD3+CD4+ клетки % 56,9 ± 10,7 51,2 ± 12,1* 109/л 3,23 ± 0,72 2,35 ± 1,04* CD3+CD8+ клетки % 21,4 ± 7,3 19,2 ± 6,1 109/л 1,25 ± 0,55 0,96 ± 1,03* CD4+CD25hi клетки % 4,19 ± 0,8 3,95 ± 1,49 109/л 0,22 ± 0,05 0,18 ± 0,09* Включение 3Н-тимидина, имп/мин спонтанное 4390 ± 2320 3900 ± 2200 ФГА-индуцированное 138 140 ± 58 600 115 040 ± 39 060* Примечание. * — p < 0,05. по следующей программе: 1 цикл — 50°С 2 мин, 95°С 10 мин; 50 циклов — 94°С 30 с, 60°С 30 с. Измерение уровня флюоресценции проводили на каждом цикле при температуре 60°С. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием параметрических (с использованием t-критерия Стьюдента) и непараметрических (с использованием ^-критерия Манна—Уитни) методов. Ранее нами подробно охарактеризовано состояние популяции Т-лимфоцитов у детей с тимомегалией разной степени выраженности [2, 8]. Здесь мы ограничимся суммарными (без учета степени тимомегалии) данными о численности, субпопуляционном составе и функциональной активности Т-клеток у детей с тимо-мегалией в сопоставлении с показателями возрастной нормы. Данные табл. 1 свидетельствуют о значимом снижении относительного и абсолютного содержания Т-клеток (CD3+-лимфоцитов), в частности, Т-хелперов (CD4+CD3+), а также абсолютного содержания цито-токсических (CD3+CD8+) и регуляторных Т-клеток (CD4+CD25hi). Значимо снижен уровень пролиферативного ответа мононуклеаров на Т-клеточный митоген фитогемаг-глютинин, что свидетельствует об ослаблении функциональной активности Т-лимфоцитов. Оценка содержания ТРЭК в мононуклеарах крови детей с тимомегалией в возрасте от 6 мес до 5 лет и детей без тимомегалии той же возрастной группы показала, что при тимомегалии число копий ТРЭК в пересчете на 1 мкг ДНК снижено в 6,18 раз (табл. 2). Наблюдаемые различия высоко достоверны. Даже если сделать поправку на более низкое содержание Численность ТРЭК в мононуклеарах крови детей возрастом до 4 лет с тимомегалией и без тимомегалии Таблица 2 Группа Средняя Медиана Минимум Максимум Нижний квартиль Верхний квартиль Группа сравнения (n = 10) 61 066 57 866 38 979 94 126 53 282 66 563 Тимомегалия (n = 8) 9 884 9 491 772 17 265 6 115 13 712 Примечание. p = 0,00078. Зависимость содержания ТРЭК в мононуклеарах периферической крови от возраста детей. Слева отмечены величины, характеризующие численность ТРЭК у обследованных детей по данным этой работы: * — с тимомегалией; о — без тимомегалии. Т-клеток у детей с тимомегалией (3,19 млрд Т-клеток в 1 л крови против 4,49 млрд Т-клеток в группе сравнения, т. е. в 1,44 раза меньше), умножив число копий у детей с тимомегалией на 1,44, полученная величина все равно будет многократно ниже, чем в группе сравнения — 4 461 против 13 304 копий на 1 мкг ДНК. Известно, что интенсивность эмиграции тимоцитов на периферию неуклонно снижается с возрастом [3, 10]. Нами рассчитана динамика числа ТРЭК в клетках крови здоровых детей в возрасте до 16 лет. При сопоставлении числа копий ТРЭК у детей от 6 мес до 5 лет с тимомегалией с показателями возрастной нормы (см. рисунок) оказывается, что оно со ответствует нормальным показателям, свойственным примерно 15-летним детям, у которых функциональная активность тимуса снижена по сравнению с детьми более раннего возраста. Таким образом, нами впервые получены прямые свидетельства ослабления эмиграции Т-клеток из тимуса в периферический отдел иммунной системы у детей первых лет жизни с тимомегалией.

About the authors

P. D Vaganov

The N.I. Pirogov Russian research medical university

A. D Donetskova

The institute of immunology, the federal medical biologic agency of Russia

N. F Nikonova

The institute of immunology, the federal medical biologic agency of Russia

I. M Danko

The N.I. Pirogov Russian research medical university

A. A Yarylin

The institute of immunology, the federal medical biologic agency of Russia

References

Supplementary files