The perspectives of application of new compounds of tiosemicarbazones class with purpose to develop pharmaceuticals with anti tuberculosis activity

Full Text

Распространение штаммов микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью на фоне ограниченного арсенала противотуберкулезных препаратов ставит под угрозу успех мероприятий по борьбе с туберкулезом и диктует необходимость создания новых противотуберкулезных средств. Перспективным путем повышения эффективности лечения туберкулеза является создание противотуберкулезных препаратов на основе химической модификации известных структур. В 50-60-х годах ХХ века были синтезированы соединения из класса тиосемикарбазонов, обладающих противотуберкулезной активностью [1], и созданы лекарственные препараты (тибон, тиоацетазон), которые в настоящее время не используются из-за низкой эффективности и высокой токсичности. В Иркутском институте химии СО РАН разработаны новые соединения производных класса тиосемикарбазонов. На основе перхлорат 4-тиоуреидоиминометилпиридиния был создан лекарственный препарат Перхлозон (ОАО "Фармасинтез", Иркутск), оказывающий выраженное, строго избирательное ингибирующее действие на жизнеспособность микобактерий туберкулеза (МБТ), особенно в отношении микобактерий бычьего типа. На моделях экспериментально го туберкулеза доказан протективный и терапевтический эффект перхлозона в условиях монотерапии, способность активировать фагоцитарную функцию макрофагов и усиливать лечебные свойства противотуберкулезных препаратов [2, 3]. Препарат разрешен для клинических испытаний и получен первый опыт его применения у больных туберкулезом [4]. В настоящее время при скрининге ряда новых соединений из класса тиосемикарбазонов на противотуберкулезную активность выделен образец с условным обозначением Phs-205, проявивший высокую активность в отношении лабораторных штаммов микобактерий человеческого и бычьего типов. Целью данного исследования явилось изучение противотуберкулезной эффективности и безопасности Phs-205 в сравнении с таковой перхлозона на модели туберкулеза мышей. Исследования проведены на 80 белых нелинейных мышах-самках массой 26-32 г (питомник "Андреевка", РАМН), которым внутривенно вводили культуру МБТ лабораторного штамма (H37Rv). Лечение животных начинали на 16-й день от момента заражения после выявления на контрольных вскрытиях макроскопически подтверж- № 3, 2014 49 денных очагов специфического воспаления в легких. Животные были разделены на 5 групп: 4 опытные в соответствии с дозами вводимых препаратов и 1 контрольная - зараженные нелеченые мыши. Phs-205 испытывали в трех дозах (10, 20 и 30 мг/кг), перхлозон в дозе 20 мг/кг при введении внутрижелудоч-но с помощью атравматического металлического зонда. Навески препаратов готовили ex tempore в 1 % крахмальном геле. Препараты вводили однократно ежедневно, без перерывов, в течение 28 дней. Зараженным нелеченым мышам в течение этого времени вводили изотонический раствор хлорида натрия. В течение исследования проводили осмотр животных, регистрировали поведенческие реакции, потребление кормов и воды. После окончания курса введения препаратов мышей умерщвляли путем декапита-ции с одновременным забором крови для проведения биохимических исследований. Эффективность химиотерапии оценивали по выживаемости мышей, изменению массы тела и весовых индексов внутренних органов, результатам патоморфологического, гистологического и микробиологического исследований. Для оценки общетоксического действия Phs-205 и перхлозона определяли в крови активность трансаминаз (АЛТ, АСТ, ед/л), содержание общего и прямого билирубина (в мкмоль/л), креатинина (в мкмоль/л), холестерина (в мкмоль/л), мочевины (в мкмоль/л). Исследование проводили на биохимическом анализаторе Sapfir-400 с использованием реактивов фирмы Diasys . Для сравнения использовали кровь от зараженных нелеченых и интактных мышей. Проводили статистическую обработку полученных результатов. Достоверность различий между группами наблюдений оценивали по критерию Стьюдента (Г.Ф. Лакин, 1980; Г.Г. Автандилов, 1980). К концу эксперимента летальность в группе контроля (зараженные, нелеченые животные) составила 60%. Лечение Phs-205 в дозе 30, 20, 10 мг/кг снизило летальность мышей до 6,6, 13,3, 26,6% соответственно. Наиболее высокий индекс эффективности по снижению летальности (89%) отмечен при использовании Phs-205 в дозе 30 мг/кг. При использовании перхлозона в дозе 20 мг/кг летальность снизилась до 40%, а индекс эффективности составил 33,3%. Защитное действие Phs-205 в дозе 30 мг/кг выражалось в сохранении массы тела мышей. При использовании Phs-205 в дозах 10 и 20 мг/кг и перхлозона отмечено достоверное снижение массы тела мышей по сравнению с исходной. В группе зараженных нелеченых животных потеря массы тела была также значительной. При вскрытии мышей наименьшие видимые морфологические изменения легких были у мышей, получавших Phs-205 в дозах 30 и 20 мг/кг. При использовании Phs-205 в дозе 10 мг/кг и перхлозона выраженность поражения легких была схожей. Значения весовых индексов внутренних органов мышей из опытных групп, пролеченных Phs-205 или перхлозоном, достоверно не отличались от таковых у нелеченых животных. При гистологических исследованиях легких зараженных нелеченых мышей выявлены выраженные мелко-, средне- и крупночаговые инфильтративно-пневмониче-ские изменения в виде диффузно-очаговых лимфомакро-фагальных скоплений, расположенных субплеврально, перибронхиально и интерстициально. В некоторых крупных очагах имелись выраженные участки казеоза. В ткани печени, почек и селезенки отмечалась значительная дис-семинация мелких лимфоцитарных гранулем. В гистологических препаратах легких мышей, получавших лечение Phs-205, отмечено сохранение архитектоники легочной ткани. В перибронхиальной ткани отдельных бронхов, в интерстиции, периваскулярно встречались ограниченные лимфомакрофагальные скопления различных размеров: мелкие - при применении Phs-205 в дозе 30 мг/кг, средние - при дозе 20 мг/кг и разнока либерные - при дозе 10 мг/кг. В ткани печени мышей, получавших Phs-205, перивенулярно встречались лимфоцитарные скопления и немногочисленные лимфоцитарные мелкие гранулемы. Отмечались проявления дистрофических изменений: от дискомплексации печеночных балок, выраженной белковой дистрофии гепатоцитов при использовании дозы 30 мг/кг до умеренно выраженной гидропической дистрофии гепатоцитов при дозе 10 мг/кг. В селезенке мышей определялись слабовыраженная гиперплазия белой пульпы и единичные в препарате мелкие эпителиоидно-клеточные гранулемы. В ткани почек имела место слабовыраженная гидропическая дистрофия извитых канальцев, проявлений туберкулезной диссеми-нации не выявлено. В гистологических препаратах легких мышей, получавших перхлозон, также сохранялась архитектоника легочной ткани. Встречались немногочисленные субми-кроскопические гранулемы. В перибронхиальной ткани местами отмечено наличие умеренной лимфоцитарной инфильтрации с небольшой примесью плазматических клеток. В ткани печени наблюдались немногочисленные субмикроскопические лимфоцитарные гранулемы на фоне умеренно выраженной гидропической дистрофии гепа-тоцитов. В ткани почек обнаружена слабовыраженная ги-дропическая дистрофия извитых канальцев, проявлений туберкулезной диссеминации не отмечено. В препаратах селезенки определялись слабовыраженная гиперплазия белой пульпы и единичные в препарате мелкие эпителио-идно-клеточные гранулемы. Установлен дозозависимый эффект при применении Phs-205: с уменьшением дозы препарата увеличивается объемная площадь поражения легких туберкулезным воспалением (с 1,93±0,39 до 6,27±0,85%). Коэффициент терапевтической эффективности по этому показателю был также самый высокий при использовании Phs-205 в дозе 30 мг на 1 кг массы и составил 95,2%. У мышей, получавших перхлозон, коэффициент эффективности составил 33,3%, а объемная площадь поражения легких туберкулезным воспалением существенно не отличалась от таковой у нелеченых животных. Анализ результатов микробиологических исследований показал, что лечение мышей Phs-205 в дозе 30 мг/кг привело к существенному снижению высеваемости МБТ из всех исследованных органов. Индекс эффективности по снижению высеваемости МБТ по сравнению с зараженными нелечеными животными составил от 58,8 до 70,3% (рис. 1). С уменьшением дозы Phs-205 снижались индексы эффективности высеваемости из легких, пече- % 80 -, 706050 -403020100- I ...... ...... I ...... ...... I phs-205, 30 phs-205, 20 phs-205,10 Легкие |: ; ; ; ;| Печень Перхлозон Селезенка Рис сти . 1. Индекс эффективности (в %) по снижению высеваемо-МБТ из легких, печени, селезенки мышей опытных групп по отношению к зараженным нелеченым мышам. 50 Российский медицинский журнал % 40 η 35 -ЗО -25 -20 -15 -10 -5 -О - % //// мт Т777Л ACT / & / Рис. 2. Отклонение биохимических показателей крови у зараженных нелеченных мышей по отношению к интактным животным. ни, селезенки: соответственно 46,2, 54,5, 28,5% при дозе 20 мг/кг и 36,6, 25,2, 22,3% при дозе 10 мг/кг. Использование перхлозона привело к достоверному снижению высеваемости МБТ из легких и печени по сравнению с зараженными нелечеными. Индекс эффективности составил 37,4 и 27,1%. По индексу эффективности использование перхлозона было равноценным результату лечения Phs-205 в дозе 10 мг/кг. Таким образом, наиболее высокий микробиологический эффект наблюдался при использовании Phs-205 в дозе 30 мг/кг. По данным литературы [5], применение перхлозона у здоровых крыс в дозе 20 мг/кг в течение 2 нед сопровождалось повышением уровня креатинина на 68%, активности АЛТ (на 31%), АСТ (в 1,5 раза), содержания билирубина (на 28%), холестерина (на 64%), мочевины (на 34%). В нашем исследовании применение Phs-205 в дозах 10-30 мг/кг и перхлозона в дозе 20 мг/кг в течение 28 дней привело к изменению изученных биохимических показателей по сравнению с таковыми у зараженных нелеченых и интактных животных (рис. 2-4). У зараженных нелеченых животных отмечено значительное повышение содержания общего билирубина (на 30,9%), активности АЛТ (на 37,6%), АСТ (на 27%), что свидетельствует о нарушении функционального состояния печени. Различия в показателях белкового и липидного обмена по сравнению с интактными животными были менее значимыми: повышение содержания холестерина на 8,3%; креатинина - на 1,2%, мочевины - на 14%. На фоне экспериментального лечения отмечено значительное снижение по сравнению с зараженными нелечеными мышами показателей активности трансаминаз, особенно у мышей, получавших Phs-205 в дозах 10-30 мг/кг. Так, активность АЛТ снизилась на 23-23,5% при использовании Phs-205 в дозах 30 и 20 мг/кг и на 48,3% при дозе 10 мг/кг. Активность АСТ снизилась на 28-25,8% при использовании Phs-205 в дозах 30 и 20 мг/кг и на 38,2% при дозе 10 мг/кг. При использовании перхлозона активность трансаминаз снизилась незначительно: на 12% АЛТ и на 10% АСТ. На фоне лечения отмечается повышение содержания холестерина по сравнению с таковым у нелеченых животных, особенно выраженное у мышей, получавших перхлозон (на 82%). Изменение содержания мочевины по сравнению с таковым у нелеченых мышей было неоднозначным: повысилось на 27% при применении перхлозона, снизилось на 3, 14, 20,8% при использовании Phs-205 в дозах 30, 20, 10 мг/кг соответственно. V1 phs-205, 30 мг/кг phs-205, 20 мг/кг У/// ш. phs-205,10 мг/кг Перхлозон Рис. 3. Отклонение биохимических показателей функциональной активности печени у мышей опытных групп по отношению к зараженным нелеченым животным. Таким образом, данные биохимических исследований свидетельствуют о более выраженном токсическом влиянии перхлозона на показатели белкового и липидного обмена. Тем не менее в гистологических препаратах печени и почек мышей, получавших Phs-205 во всех дозах, отмечались проявления гидропической дистрофии гепато-цитов от умеренной до слабой степени выраженности и слабовыраженная гидропическая дистрофия извитых канальцев почек. Аналогичные изменения были характерны для печени и почек мышей, получавших перхлозон. На основании полученных результатов сравнительного изучения Phs-205 и перхлозона можно заключить, что соединение Phs-205 в дозе 30 мг/кг оказывает наиболее выраженное лечебное действие при экспериментальном % phs-205, 10 мг/кг Перхлозон Рис. 4. Отклонение показателей белкового и липидного обмена у мышей опытных групп по отношению к зараженным нелеченым животным. № 3, 2014 51 туберкулезе, вызванном микобактериями туберкулеза штамма H37Rv. Представляется перспективным дальнейшее изучение Phs-205 в дозе 30 мг/кг в схемах комплексной химиотерапии экспериментального туберкулеза.

About the authors

G. N Mojokina

The I.M. Sechenov first Moscow medical university of Minzdrav of Russia; The research institute of phthisiopulmonology

Email: mojokina@mail.ru

N. A Elistratova

The I.M. Sechenov first Moscow medical university of Minzdrav of Russia; The research institute of phthisiopulmonology

I. P Soloviyeva

The I.M. Sechenov first Moscow medical university of Minzdrav of Russia; The research institute of phthisiopulmonology

A. S Guschin

“The Pharmasynthesis”

Irkutsk

V. N Elokhina

“The Pharmasynthesis”

Irkutsk

References

Supplementary files