The study of thymopoesis in children with thymomegalia using identification of thymus excisional rings

Full Text

У детей (особенно в возрасте до 3-5 лет) нередко наблюдается увеличение размеров вилочковой железы (тимуса). В отечественной литературе подобное состояние определяется как тимомегалия. Некоторые исследователи рассматривают увеличение размеров тимуса у детей как возможный вариант нормы. Однако в большей части работ у детей с тимомегалией, кроме отягощенного анамнеза, выявлены различные иммунологические и гормональные нарушения [1-4]. Значительная распространенность увеличения вилочковой железы у детей вызывает повышенный интерес к данной проблеме не только педиатров, но и других специалистов. Тимус является основным органом лимфопоэза у человека. В нем созревают, проходят селекцию и диф- ференцировку Т-лимфоциты. Т-клетки, недавние мигранты из тимуса, несут так называемые Т-рецепторные эксцизионные кольца (ТРЭК - T-cell receptor excision circle) - следы недавно произошедшей перестройки генов Т-клеточного рецептора - TCR [5-7]. Так называют кольцевые молекулярные структуры, образующиеся в процессе реаранжировки V- генов в результате замыкания в кольцо участков ДНК, вырезаемых из зародышевых V-генов [5]. Различают сигнальные и кодирующие эксцизионные кольца, которые образуются соответственно при реаранжировке гена 5- и a-цепей (ген TRDV локализован внутри кластера TRAV и может подвергаться перестройке дважды - при построении зрелых генов TRDV и TRAV). Эти кольца находятся в Т-клетках некоторое время после их выхода из тимуса и служат маркером «недавних тимических мигрантов». Клетки, содержащие ТРЭК, обладают функцией Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов. Однако их функциональная активность выражена слабее, чем у аналогичных клеток периферического отдела иммунной системы (например, они слабее секретируют IL-2 и IFN-y в условиях активации). Данные об изменении численности «недавних мигрантов из тимуса» рассматриваются как показатели функции тимуса и являются на сегодняшний день единственным непосредственным методом оценки тимического развития Т-лимфоцитов [8]. Эти структуры определяются с помощью ПЦР. В настоящее время основными патологическими состояниями, при которых исследование уровня ТРЭК на клиническом уровне стало реальностью, являются первичные Т-клеточные иммунодефициты [9]. В нашей работе мы попытались оценить функциональное состояние тимуса с помощью определения ТРЭК у детей с тимомегалией методом ПЦР в реальном времени. Уровень ТРЭК в лимфоцитах периферической крови пациентов с тимомегалией в сравнении с лицами без увеличения тимуса Возраст, годы Лица с тимомегалией Лица без тимомегалии число обследованных ТРЭК, копий на 1000 лимфоцитов число обследованных ТРЭК, копий на 1000 лимфоцитов До 2 30 29,62*(18,19-41,09) 10 73,34 (53,99-83,84) 2-10 13 8,90* (4,82-14,16) 36 16,37 (8,65-36,38) 11-18 4 2,17 (1,64-3,51) 17 5,02 (2,59-5,91) 40 11 3,39 (0,74-5,21) [14] 1 0,01 Примечание.* - p < 0,05 в сравнении с контрольной группой. Материал и методы Уровень ТРЭК определяли у 47 детей с тимомегалией в возрасте от 1,5 мес до 18 лет (также обследован 1 человек 40-летнего возраста). Большинство детей с тимомегалией были в возрасте до 5 лет (42 ребенка). Больные находились на стационарном лечении в Моро- зовской детской городской клинической больнице. У 23 детей в возрасте до 2 лет диагностирован острый простой/об- структивный бронхит, материал для исследования был взят при поступлении в стационар до начала лечения. Остальные пациенты были из группы часто болеющих детей. Число ТРЭК определяли также у 53 детей без тимомегалии (группа сравнения), из них у 9 детей в возрасте до 2 лет диагностирован бронхит. У детей с тимомегалией размер тимуса определяли рентгенологически. Мерой выраженности тимомега- лии был кардио-тимико-торакальный индекс (КТТИ), который определяли по отношению ширины тимуса к ширине грудной клетки на уровне куполов диафрагмы. В исследование отобраны дети с тимомегалией II степени (0,37 < КТТИ < 0,42). до 10 лет до 20 лет Возраст Рис. 1. Возрастные различия уровня ТРЭК у здоровых и лиц с тимомегалией. * - p<0,05. Тимомегалия -•-Здоровые лица Из венозной крови обследованных детей выделяли мононуклеары периферической крови с помощью центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-верографин («Sigma»). Из 1 • 106 моно- нуклеаров выделяли ДНК с использованием набора «Проба НК» («ДНК-Технология»). Для проведения ПЦР применяли набор TaqMan Universal PCR Master Mix Reagents Kit («Applied Biosystems»). Для определения ТРЭК (сигнальных эксцизионных колец) использованы праймеры: прямой 5’-CGTGAGAACGGTGAATGA AGA GCAGACA-3’, обратный 5 ’ -C ATCCCTTTC AACC A TGCTGACACCTCT-3’, зонд 5 ’ -FAM-TTTTT GTAA AGGTGCCCACTCCTGTGCACGGTGA-MGB-3’ («Син- тол») [10]. ПЦР ставили в объеме 25 мкл на приборе «7300 Applied Biosystems Real-time PCR System». Программа амплификации: 1 цикл - 50 °С в течение 2 мин, 95°С 10 мин; 50 циклов - 94°С 30 с, 60°С в течение 1 мин. Расчет числа копий ТРЭК проводили с использованием стандартной кривой, построенной по разведениям плазмиды с известной концентрацией ДНК ТРЭК. Плазмида получена путем клонирования ДНК ТРЭК тимоци- тов человека в вектор pJet1.2/Blunt («Fermentas»). Результаты выражали числом копий ТРЭК на 1000 лимфоцитов. Статистическую обработку проводили методами непараметрического анализа. Исследованные количественные показатели представлены в виде Ме (LQ-UQ), где Ме - медиана, LQ - нижний квартиль, UQ - верхний квартиль. Для сравнения двух независимых выборок по количественным признакам использован U-критерий Манна-Уитни. Различие групп полагали статистически значимым при p<0,05. Результаты и обсуждение Ранее нами было показано, что при тимомегалии у детей отмечаются Т-лимфопения, затрагивающая в основном CD4+-клетки, а также ослабление активации Т-клеток [4, 11-13]. Поскольку увеличение размера тимуса неизбежно сочетается с нарастанием числа тимо- цитов, можно констатировать, что это нарастание парадоксальным образом связано с уменьшением количества Т-клеток на периферии и снижением их функциональных потенций. Уменьшение количества Т-клеток на периферии может быть результатом сдвига баланса прироста их числа, обусловленного притоком Т-клеток из тимуса и их пролиферацией на периферии, и убыли клеток, связанной с их гибелью. Ни спонтанная пролиферация, ни спонтанный апоптоз Т-клеток у детей с тимомегалией не изменены [13]. Остается допустить возможность ослабленной эмиграции Т-клеток из тимуса, роль которой в становлении популяции Т-лимфоцитов в детском возрасте весьма существенна. В нашей работе мы провели исследование эмиграции Т-клеток из тимуса. В таблице представлены данные о содержании ТРЭК в лимфоцитах крови пациентов с тимомегалией в сравнении с таковым у лиц без увеличения тимуса (обследован 1 человек 40-летнего возраста, группа сравнения для него взята из нашей предыдущей статьи [14]). Оценка содержания ТРЭК в лимфоцитах крови детей с тимомегалией в возрасте до 2 лет и детей без тимомега- лии той же возрастной группы показала, что при тимоме- галии число копий ТРЭК в пересчете на 1000 лимфоцитов снижено в 2,5 раза - 29,6 (18,1-41,0) копии против 73,3 (54,0-83,8) копии в контроле (см. таблицу). Наблюдаемые различия высокодостоверны (д=0,001). При сопоставлении числа копий ТРЭК у детей до 2 лет с тимоме- галией с показателями возрастной нормы, отраженными на рис. 1, оказалось, что они соответствуют нормальным показателям, свойственным примерно 8-летним детям, у которых функциональная активность тимуса снижена по сравнению с детьми более раннего возраста. В дальнейшем (после 2 лет) разница в уровне ТРЭК у детей с тимомегалией в сравнении с детьми без увеличения тимуса менее выражена: в возрасте до 10 лет она составляет 1,8 раза. Тимомегалия у лиц старшего возраста - довольно редкая патология; тем не менее обследование единственного пациента 40 лет с тимомегалией показало практически полное отсутствие в клетках его крови ТРЭК (0,01 копии на 1000 клеток), что значительно ниже возрастной нормы (3,39 копии/тыс. клеток [14]). Пример прохождения ПЦР в реальном времени для оценки содержания ТРЭК в лимфоцитах крови здорового ребенка и ребенка с тимомегалией приведен на рис. 2. Ранее нами показано, что среди иммунологических отклонений, зарегистрированных у детей с тимомега- лией, наиболее постоянно проявляется Т-лимфопения с преобладающим снижением содержания CD4+-лимфоцитов, уровня пролиферативного ответа Т-клеток на митоген [13]. Кроме того, в предыдущих работах нами выявлено снижение содержания естественных регуляторных CD4+CD25hi-Т-клеток и их основного внутриклеточного маркера FохP3, а также усиление экспрессии генов супрессорных цитокинов TGF-P, IL-10 и IL-6 [15]. В этих работах нами высказано предположение, что снижение содержания T-лимфоцитов и их субпопуляций в крови детей раннего возраста с тимомегалией обусловлено общим ослаблением продуктивного Т-лимфопоэза. В настоящей работе мы нашли подтверждение этому факту: нами получены прямые свидетельства ослабления эмиграции Т-клеток из тимуса в периферический отдел иммунной системы у детей с тимомегалией, т. е. ослабления у них процессов Т-лимфопоэза в тимусе. Delta Rn vs Cycle Cycle Number Рис. 2. Пример прохождения ПЦР для оценки содержания ТРЭК в лимфоцитах крови здорового ребенка и ребенка с тимомегалией одинакового возраста. Представлены кривые накопления продуктов амплификации (в дублях): 1 - ДНК ТРЭК здорового ребенка; 2 - ДНК ТРЭК ребенка с тимомегалией; 3 - ДНК стандартов (107, 106, 105, 104, l03, 102, 101 копий/мкл). По оси абсцисс - номер цикла ПЦР; по оси ординат - Delta Rn (различие между значением Rn (нормированной репортерной флюоресценции) для реакционной смеси и фоновой флюоресценцией). В данной работе мы не касались вопроса о клинической значимости увеличения размеров тимуса. Тем не менее возникает вопрос о том, могут ли изменения иммунологических показателей, наблюдавшиеся у детей с тимо- мегалией, стать причиной иммунодефицита, имеющего клинически значимые последствия. В нашей работе показано, что у детей с тимомегалией имеет место ослабление выхода зрелых Т-клеток из тимуса, что, по-видимому, приводит к Т-лимфопении (в основном за счет снижения содержания CD4+-Т-клеток), с некоторым ослаблением уровня пролиферативного ответа на мито- ген, и эндогенной активации Т-клеток [13]. Эти изменения вызывают функциональный дефицит Т-клеточного звена иммунной системы и могут способствовать проявлению ее несостоятельности. Поэтому детей с тимомега- лией следует рассматривать как детей из группы риска, предрасположенных к более частому возникновению заболеваний. Ослабление эмиграции Т-лимфоцитов при тимомегалии может также стать причиной усиления гомеостатической пролиферации, которая может исказить структуру популяции периферических Т-лимфоцитов и привести к нежелательным последствиям (например, таким, как аутоиммунная патология) в отдаленные сроки.

About the authors

Almira D. Donetskova

The state research center institute of immunology of the Federal medical biological agency of Russia

Email: almira_donetskova@yahoo.com
MD, PhD, DSc 115478 Moscow, Russia

P. D Vaganov

The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia

117997 Moscow, Russia

M. F Nikonova

The state research center institute of immunology of the Federal medical biological agency of Russia

115478 Moscow, Russia

E. Yu Yanovskaia

The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia

117997 Moscow, Russia

E. T Mandzhieva

The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia

117997 Moscow, Russia

E. M Rodionova

The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia

117997 Moscow, Russia

I. M Donin

The Morosovskaia children municipal clinical hospital of the Moscow health department

119049 Moscow, Russia

M. A Pushkarev

The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia

117997 Moscow, Russia

A. A Yarilin

The state research center institute of immunology of the Federal medical biological agency of Russia

115478 Moscow, Russia

References

Supplementary files