The effect of tactivin therapy on T-lymphopoiesis under thymomegalia in children of early age with acute obstructive bronchitis

Full Text

У детей раннего возраста часто наблюдается гиперплазия лимфоидной ткани, в том числе ткани вилочкой железы - тимомегалия [1-3]. Множество проведенных исследований показывают, что такие дети уже на первом году жизни чаще болеют острыми респираторными инфекциями, анемией, рахитом, различными нарушениями питания, у них чаще развиваются аллергические реакции [2-4]. В возрасте до 3 лет более половины детей с увеличенной вилочковой железой относятся к группе часто болеющих детей с более тяжелым и длительным течением ОРВИ [1]. Подобные клинические проявления являются результатом нарушения функцио18 Российский медицинский журнал нирования иммунной системы при тимомегалии [1, 5-7]. Было выявлено, что при гиперплазии вилочковой железы у детей, несмотря на увеличение количества тимоцитов в ней, наблюдается Т-лимфопения с преимущественным снижением СБ4+-клеток [1, 7, 8]. В предыдущих работах нами было проведено исследование функционального состояния вилочковой железы при тимомегалии у детей, а именно изучение процессов Т-лимфопоэза посредством показателей, характеризующих эмиграцию Т-клеток из нее; было показано, что функциональная активность вилочковой железы у детей с тимомегалией снижена по сравнению с возрастной нормой [9, 10]. Ранее было показано, что иммуномодулирующий препарат тактивин оказывает положительное влияние, направленное на предупреждение частых интеркуррент- ных инфекций при тимомегалии у детей [11]. При терапии тактивином детей с тимомегалией во время острого респираторного процесса отмечается положительная динамика: более быстрое исчезновение кашля, менее выраженные катаральные явления, отсутствие затяжного и осложненного течения заболевания, в иммунологическом плане тактивин способствует увеличению количества Т-лимфоцитов и их субпопуляций (СБ4, CD8) [1, 11]. В настоящей работе мы провели исследование влияния иммуномодулятора тактивина («Биомед») на Т-лимфопоэз при тимомегалии у детей раннего возраста с острым обструктивным бронхитом (ООБ). Оценку Т-лимфопоэза осуществляли по уровню ТРЭК (Т-рецепторных эксцизионных колец). ТРЭК представляют собой кольцевидные молекулы ДНК, которые формируются в процессе перестройки генов Т-клеточного рецептора при дифференцировке Т-лимфоцитов в ви- лочковой железе [12]. Данные структуры определяются только в Т-клетках, недавно эмигрировавших из нее и служат мерой интенсивности созревания Т-лимфоцитов и их эмиграции из вилочковой железы, т.е. функциональной активности этого органа [13, 14]. Материал и методы Уровень ТРЭК определяли у 8 детей с тимомегалией в возрасте от 1,5 мес до 1 года. У всех детей был диагностирован ООБ в стадии разгара. Больные находились на стационарном лечении в Морозовской детской городской клинической больнице. С момента поступления дети получали тактивин («Биомед») интраназально в дозе 1 мкг/ кг ежедневно в течение 5 дней [11]. Тяжесть состояния: лихорадка с температурой тела более 39°С, вялость, кашель, втяжение межреберных промежутков, появление цианоза, учащенное шумное дыхание со свистящим выдохом, рассеянные сухие хрипы, а иногда и влажные среднепузырчатые хрипы в легких, отказ от питья, «воспалительные» изменения в анализе периферической крови и другие признаки интоксикации - явилась основанием для назначения всем детям антибактериальной терапии. Для лечения бронхообструктивного синдрома включали мероприятия по улучшению дренажной функции бронхов, противовоспалительную и бронхолитическую терапию. Помимо тактивина другие иммуномодуляторы в лечении детей этой группы не применялись. Забор крови проводили дважды: до начала лечения и через 1 день после окончания терапии тактивином. В группу сравнения вошли 3 ребенка с ООБ и ти- момегалией, находящиеся на стационарном лечении и получающие аналогичную терапию, но без введения тактивина, обследованные при поступлении и повторно через 6 дней. Из периферической крови обследованных детей выделяли мононуклеары путем центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности фиколла-верогра- фина (Sigma). Из 1*106 мононуклеаров выделяли ДНК с помощью набора «Проба НК» («ДНК-Технология»). Для постановки ПЦР использовали набор TaqMan Univrsal PCR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosystems). Для определения ТРЭК использованы праймеры: прямой 5’- CGT GAG AAC GGT GAA TGA AGA GCA GAC A-3’, обратный 5’-CAT CCC TTT CAA CCA TGC TGA CAC CTC T-3’, зонд 5’-FAM-TTT TTG TAA AGG TGC CCA CTC CTG TGC ACG GTG A-MGB-3’ («Синтол») [15]. Объем смеси для ПЦР составлял 25 мкл. Программа амплификации на приборе 7300 Applied Biosystems Realtime PCR System: 1 цикл - 50°С 2 мин, 95°С 10 мин; 50 циклов - 94°С 30 с, 60°С 30 с. Расчет числа копий ТРЭК проводили с использованием стандартной кривой, построенной по разведениям плазмиды с известной концентрацией ДНК ТРЭК. Плазмида получена путем клонирования ДНК ТРЭК тимоцитов человека в вектор pJet1.2/Blunt (Fermentas). Результаты представлены числом копий ТРЭК на 1 тыс. лимфоцитов. Статистическую обработку проводили методами непараметрического анализа. Исследованные количественные показатели представлены в виде Ме (LQ - UQ), где Ме - медиана, LQ - нижний квартиль, UQ - верхний квартиль. Для анализа связи различий между связанными выборками применяли критерий Вилкоксона. Различие групп полагали статистически значимым при р<0,05. Результаты и обсуждение В предыдущих статьях нами было подробно охарактеризовано состояние Т-лимфопоэза, оцениваемое по уровню ТРЭК, при тимомегалии у детей [9, 10]. В настоящей работе мы попытались исследовать тимопоэз при воздействии пептидных гормонов тимуса (на примере тактивина). Измерение уровня ТРЭК проводили после применения тактивина (5-дневный курс интраназально) в небольшой группе детей раннего возраста с ООБ и ти- момегалией. Вопрос о клинической эффективности тактивина в лечении острых респираторных заболеваний достаточно широко изучен [1, 11, 16]. В нашей работе мы не касались этой области, а лишь попытались оценить ти- мопоэз после применения тактивина по содержанию недавних эмигрантов из тимуса у детей раннего возраста с тимомегалией и ООБ. Полагаем, что такое исследование правомочно, так как тактивин является аналогом тимических гормонов - модуляторов функционирования Т-лимфоцитов и эпителиальных клеток. Уровень ТРЭК у детей с тимомегалией и ООБ до терапии тактивином составил 17,62 (11,81-35,72) копий на 1 тыс. лимфоцитов (17,36 (8,29-29,33) копий на 1 тыс. лимфоцитов в группе сравнения). Ранее нами было показано снижение содержания ТРЭК при тимоме- галии в сравнении с детьми с нормальными размерами вилочковой железы [10]. В таблице представлены данные по динамике уровня ТРЭК у детей раннего возраста с тимомегалией после Влияние терапии тактивином на численность ТРЭК (копий на 1 тыс. лимфоцитов) в лимфоцитах периферической крови детей раннего возраста с тимомегалией Группа При поступлении Через 6 дней Дети, получавшие 17,62 58,10* терапию тактивином (11,81-35,72) (27,43-80,40) Группа сравнения 17,36 (8,29-29,33) 10,02 (9,87-21,33) Примечание. * - p = 0,01 относительно содержания ТРЭК до лечения. № 4, 2015 19 лечения тактивином. Как видно из таблицы, добавление тактивина (интраназально в течение 5 дней) в комплексное лечение ООБ приводит к статистически значимому повышению содержания ТРЭК: до 58,10 (27,43-80,40) копий на 1 тыс. лимфоцитов периферической крови (р=0,01 для критерия Вилкоксона). Причем уровень ТРЭК достигает 80% содержания ТРЭК у здоровых детей без тимомегалии - 73,34 (53,99-83,84) копий на 1 тыс. лимфоцитов (р=0,4) [10]. В группе сравнения уровень ТРЭК-содержащих клеток не изменяется (p>0,05 для критерия Вилкоксона). Таким образом, наше исследование показало статистически значимое повышение содержания ТРЭК в лимфоцитах периферической крови после применения тактивина в комплексной терапии ООБ (p=0,01 для критерия Вилкок- сона). Причем уровень ТРЭК практически достигал содержания ТРЭК у детей без тимомегалии. Следовательно, можно сделать предположение, что добавление тактивина в комплексное лечение ООБ может способствовать восстановлению Т-лимфопоэза при тимомегалии. До настоящего времени считалось, что основой фармакологического действия тактивина является стимуляция Т-клеточного иммунного ответа при его снижении: усиление выработки Th1-цитокинов (в том числе IL-2 и IFNy) и активности цитотоксических Т-клеток, нормализация численности Т-лимфоцитов, соотношения Т- и В-клеток, а также субпопуляций Т-клеток; кроме того, он оказывает благоприятное действие на функцию кроветворных стволовых клеток [11, 16, 17]. Предполагалось, что пептидные гормоны тимуса обусловливают некоторое «дозревание» Т-лимфоцитов в периферическом отделе иммунной системы, однако точных экспериментальных данных, подтверждающих этот феномен, не существовало [18]. Настоящая работа показывает, что еще одним эффектом лекарственных препаратов на основе пептидов вилочковой железы может являться их влияние на дифференцировку Т-клеток. Однако для утверждения о том, что фармакологическое действие так- тивина связано с его влиянием на эмиграцию Т-клеток из вилочковой железы необходимо увеличить объем выборки и продолжить исследования в этом направлении.

About the authors

P. D Vaganov

The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia

117997 Moscow, Russia

Almira D. Donetskova

The state research center institute of immunology of the Federal medical biological agency of Russia

Email: almira_donetskova@yahoo.com
MD, PhD 115478 Moscow, Russia

M. F Nikonova

The state research center institute of immunology of the Federal medical biological agency of Russia

115478 Moscow, Russia

E. Yu Yanovskaya

The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia

117997 Moscow, Russia

E. E Petryaikina

The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia; The Morozovskaia children municipal clinical hospital of the health department of Moscow

117997 Moscow, Russia

I. A Pugacheva

The Morozovskaia children municipal clinical hospital of the health department of Moscow

119049 Moscow, Russia

I. R Samsonovich

The Morozovskaia children municipal clinical hospital of the health department of Moscow

119049 Moscow, Russia

A. A Yarilin

The state research center institute of immunology of the Federal medical biological agency of Russia

115478 Moscow, Russia

References

Supplementary files