Modeling of a Different Volume Spinal Cord Injury in Rats and Methods for Evaluation of Lost Functions Restoration (part 2)

Full Text

Введение. Электрофизиологические методы исследования незаменимы не только при оценке нарушений проводимости нервных путей, вызванных повреждением спинного мозга, но и при оценке степени ее последующего восстановления. В настоящее время в изучении последствий травм спинного мозга широко применяются модели повреждения на лабораторных животных, в основном на крысах и мышах. Ввиду доступности, знания генетических и биохимических характеристик, эти модели удобны для изучения молекулярных механизмов вторичного повреждения и восстановления после травмы спинного мозга. Также они позволяют с достаточно большой точностью моделировать повреждения различной выраженности и локализации [1-3]. Для определения степени нарушения и восстановления неврологических функций применяются методы поведенческой оценки. Однако поведенческие признаки в большинстве случаев отражают комплексные процессы сенсомоторной интеграции и не позволяют с большой степенью уверенности дифференцировать нарушение целостности чувствительных и двигательных путей [4]. При повреждении спинного мозга в грудном отделе у грызунов нарушается координация движений, и, в зависимости от выраженности повреждения, снижается или полностью выпадает моторная функция задних конечностей. Проведение электрофизиологического исследования необходимо для объективной оценки функциональной целостности проводящих путей спинного мозга после его повреждения. Однако в связи с небольшими размерами экспериментальных животных электрическая стимуляция и регистрация ответных импульсов представляет определенные трудности. Среди множества способов фиксирования электрической активности ЦНС регистрация вызванных потенциалов (ВП) представляет одну из наиболее эффективных методик исследования функций ЦНС. В отличие от ЭЭГ или ЭМГ, посредством которых измеряется спонтанная электрическая активность нейронов, применение методики ВП обеспечивает значительно больший контроль над параметрами исследования, так как дает возможность регистрировать нейрональную активность, являющуюся прямым ответом на воздействие внешнего электрического стимула. Ответные нервные импульсы могут быть отслежены на любом уровне, включая периферические чувствительные импульсы, центральную нервную активность и ответные двигательные импульсы. Возникший в результате стимуляции отдельного периферического нерва импульс может быть зарегистрирован в любой точке по всей длине нерва или спинальных соматосенсорных проводящих путей, в том числе в субкортикальных и кортикальных структурах [2]. Вызванный потенциал представляет собой местное изменение электрического поля нервной структуры, которое следует за воздействием внешнего стимула. Так как амплитуда ВП сравнима с амплитудой спонтанной активности нейронов, он может «теряться» среди этих фоновых электрических изменений. В связи с этим возникают проблемы с регистрацией конкретного потенциала в физиологических условиях. Необходимый сигнал должен быть выделен из фонового шума. Наиболее часто в этих целях применяется методика «усреднения». Так как при спонтанной активности регистрируются практически беспорядочные положительные и отрицательные значения, при суммации их среднее значение стремится к нулю. Таким образом, при условии, что стимул не влияет на спонтанную электрическую активность, суммация сигналов приводит к устранению фонового шума [5, 6]. В 1947 г. Dawson впервые успешно выделил ВП на фоне спонтанной электроэнцефалографической активности путем наложения фотографий последовательных записей ЭЭГ. В результате этого ему удалось изолировать ответ на единичный электрический стимул и минимизировать шумовые потенциалы электрической активности мозга, не связанной с вызванным потенциалом [7]. Позднее была использована методика электронной суммации сигналов [8]. С появлением компьютерной техники, начиная с работ Clark, регистрацию ВП осуществляли с помощью различных методик цифрового усреднения [3]. В 1970 г. Jewett использовал методику регистрации потенциалов головного мозга в ответ на слуховой стимул с помощью усреднения, что дало начало целому ряду исследований электрической активности ЦНС при помощи ВП [9]. В зависимости от природы и механизма внешнего электрического воздействия выделяют две группы ВП - сенсорные и моторные. Сенсорные ВП вызываются путем стимуляции афферентных путей и включают соматосенсорные, визуальные и слуховые. Моторные ВП получают в результате воздействия на эфферентные пути на разных уровнях. Обычно проводится стимуляция моторной области коры головного мозга или шейного отдела спинного мозга. При этом регистрацию осуществляют с нижележащих отделов спинного мозга, периферических нервов или мышц-мишеней. Сенсорные ВП в свою очередь можно разделить на коротколатентные (<10 мс), среднелатентные (10-50 мс) и длиннолатентные (>50 мс). Коротколатентные ВП обычно достаточно устойчивые и мало подвержены влиянию состояния исследуемого животного и анестезии. Среднелатентные ВП отражают переход между состоянием сна и бодрствования и в большей мере подвержены влиянию анестезии. Длиннолатентные ВП в наибольшей степени зависят от анестезии и активности ЦНС [10]. Моторные ВП обычно регистрируют электродами, установленными в мышцах или в непосредственной близости от спинного мозга. Наиболее часто их используют с диагностической целью для оценки целостности центральных двигательных путей [1, 11] Нейрофизиология спинного мозга может быть изучена при помощи ВП практически на любом его уровне, включая периферические афферентные пути, интраспинальные пути, субкортикальные и кортикальные структуры. Функциональное состояние спинного мозга может быть исследовано путем применения как соматосенсорных, так и моторных ВП. Существует множество методик регистрации ВП. Различаются они в основном видом используемых электродов и расположением стимулирующего и регистрирующего электродов. Электроды классифицируются в зависимости от необходимости их имплантации. Выделяют нехирургические и хирургические электроды. Нехирургические включают клипсы или диски, которые крепятся к поверхности кожи, игольчатые электроды, которые вводятся подкожно или чрескожно между позвонков. Хирургические электроды включают, электроды, имплантируемые в кость, проволочные электроды, имплантируемые в периферические нервы, жесткие и гибкие эпидуральные электроды и капиллярные игольчатые электроды для интраспинального и интраганглиарного воздействия [12, 13]. В зависимости от расположения электродов функциональное состояние спинного мозга можно отслеживать вдоль всего спинального канала или в области черепа. Все эти области могут использоваться как для стимуляции, так и для регистрации ВП. Регистрация потенциалов вдоль спинного мозга дает подробную информацию о конкретных структурах и функциях этого органа. Регистрация стандартного соматосенсорного ВП ( ССВП) отображает волны, соответствующие пресинаптическим компонентам, постсинаптическим интернейронным компонентам и постсинаптическим ответам моторных нейронов. Изменения в соответствующих волновых параметрах может указывать на уровень повреждения конкретной функциональной единицы спинного мозга [1, 11, 13]. Цель исследования: отработка методики регистрации вызванных соматосенсорных потенциалов в условиях повреждения проводящих путей спинного мозга в эксперименте. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследование проведено на 100 лабораторных животных - самках крыс породы Вистар массой 220-260 г. Эксперимент осуществляли в соответствии с «Рекомендациями комитетам по этике, проводящим экспертизу биомедицинских исследований» (ВОЗ, 2000) и «Директивами Европейского сообщества» (86-609 ЕЕС). Животные были разделены на 5 групп по 20 крыс в зависимости от объема повреждения: 1-я группа - пересечение 50% спинного мозга; 2-я группа - 80-90% спинного мозга; 3-я группа - полное пересечение спинного мозга (плотный контакт поврежденных концов спинного мозга); 4-я группа - резекция сегмента спинного мозга длиной 1 см; 5-я группа - полное пересечение спинного мозга с отсутствием контакта в зоне повреждения (концы спинного мозга в зоне повреждения разведены). Все операции осуществлялись одной хирургической бригадой с использованием оптического микроскопа Carl Zeiss и микрохирургического инструментария по методике, описанной ранее [14]. Ведение животных в раннем послеоперационном периоде осуществляли в условиях, способствовавших наиболее эффективному восстановлению животных [14]. Регистрирующий игольчатый электрод устанавливали в череп животного в область проекции сенсомоторной коры, а стимулирующий - в область мышц сгибателей бедра (рис. 1). Стимуляцию проводили при помощи изолированного стимулятора постоянным током со следующими параметрами: 3 мА, продолжительность стимула 20 мс, частота 0,5 Гц. Обработку данных и статистический анализ осуществляли с помощью программного обеспечения MATLAB и StatSoft STATISTICA 8.0. Для определения статистической значимости различий в независимых группах для множественного сравнения использовали тест Краскела - Уоллиса, для попарного сравнения групп - U-тест Манна - Уитни с поправкой Бонферони. Критический уровень значимости при статистической проверке гипотез был принят равным 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ Соматосенсорные вызванные потенциалы измеряли у всех животных до операции для получения исходных значений амплитуды и межпиковой латентности. В 1-е сутки после операции регистрируемые ССВП демонстрировали значительное снижение амплитуды и увеличение межпиковой латентности, что говорит о количественном снижении проводимости сигналов и снижении скорости передачи сигнала в области повреждения (рис. 2). В группе с 50% пересечением спинного мозга амплитуда регистрируемого в 1-е сутки после операции потенциала снизилась на 87,8±5,5% (р<0,05; см. рис. 2 , а), в то время как межпиковая латентность увеличилась почти в 2 раза. При пересечении 80% спинного мозга пики ССВП практически не регистрировались: амплитуда ССВП была снижена на 95,2±3,2% (р<0,05; см. рис. 2 , б). В случаях полного пересечения и разведения концов спинного мозга, а также при его резекции с диастазом концов в 1 см проводимость тканей спинного мозга была полностью нарушена (см. рис. 2, в). При анализе динамики проводимости спинного мозга лабораторных животных в течение 45 дней после его пересечения было выявлено, что незначительное спонтанное восстановление проводимости имело место только в группе с 50% пересечением (рис. 3, а). Средние показатели амплитуды ССВП в 1-е сутки после операции составляли 9,1±2,6% (р<0,05) от исходной амплитуды (в среднем 45±10 мкВ). Через неделю наблюдалось увеличение амплитуды до 13,5±2,7% (р<0,05). Через 2 нед после пересечения амплитуда увеличивалась в среднем до 16,4±1,5% (р<0,05). В последующем статистически значимого увеличения амплитуды не наблюдалось. Также в 1-е сутки в среднем на 87±15,5% (р <0,05) увеличивалась межпиковая латентность (исходная латентность в этой группе в среднем составила 23,5±5,9 мс). Однако в последующем статистически значимых изменений межпиковой латентности не наблюдалось. При пересечении спинного мозга на 80% (рис. 3, б) в 1-е сутки амплитуда ССВП снижалась до 3,2±1,5% от исходной (38±5,7 мкВ). В последующем статистически значимых изменений амплитуды не наблюдалось. Определить значения межпиковой латентности в большинстве случаев не представлялось возможным. При полном пересечении спинного мозга ССВП практически не регистрировались (рис. 3, в). При полном пересечении и разведении концов спинного мозга, а также при его резекции проводимость спинного мозга полностью нарушалась. ОБСУЖДЕНИЕ Применение методики регистрации ССВП позволяет достоверно и точно оценить состояние проводящих путей спинного мозга при высокой воспроизводимости экспериментальных данных. Методика хорошо зарекомендовала себя в научном сообществе и широко применяется в работах по изучению физиологии ЦНС наряду с механо-функциональными и визуальными способами оценки ее функционального состояния [4, 11]. Результаты, полученные в настоящем исследовании, подтверждают эффективность методики регистрации ВП при оценке степени проводимости структур ЦНС. Несмотря на ее трудоемкость и необходимость в специальном лабораторном и электронейрофизиологическом оборудовании, она дает возможность объективно оценить тяжесть повреждения тканей спинного мозга, а также степень и скорость их восстановления. В ходе работы была продемонстрирована корреляция между объемом повреждения и степенью проводимости спинного мозга, подтверждены данные литературы о практически полном отсутствии спонтанной регенерации тканей спинного мозга в долгосрочном периоде при его механическом повреждении. При этом при неполном пересечении спинного мозга все же наблюдалось некоторое количественное восстановление проводимости его тканей, что может быть связано с пластичностью ЦНС или с локальными трофическими изменениями, сопровождающими уменьшение последствий воспалительной реакции в позднем послеоперационном периоде. Отсутствие или крайне низкая эффективность регенеративных процессов в тканях ЦНС также подтверждаются описанным в данном исследовании отсутствием положительной электрофизиологической динамики при полном пересечении и резекции участка спинного мозга в позднем послеоперационном периоде.

About the authors

S. P Mironov

Central Institute of Traumatology and Orthopaedics named after N.N. Priorov

S. V Kolesov

Central Institute of Traumatology and Orthopaedics named after N.N. Priorov

G. A Stepanov

Central Institute of Traumatology and Orthopaedics named after N.N. Priorov

M. L Sazhnev

Central Institute of Traumatology and Orthopaedics named after N.N. Priorov

Email: mak.sajnev@yandex.ru

S. P Gubin

Kurnakov Institute of General and Inorganic Chemistry, Moscow, Russia

Yu. V Ioni

Kurnakov Institute of General and Inorganic Chemistry, Moscow, Russia

V. G Motin

Central Institute of Traumatology and Orthopaedics named after N.N. Priorov

A. A Panteleev

Central Institute of Traumatology and Orthopaedics named after N.N. Priorov

References

Supplementary files