Сравнительный анализ эффективности протоколов очистки костного матрикса

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Применение остеопластических материалов, направленных на увеличение объема собственной кости и на закрытие костных дефектов, уже давно вошло в ежедневную практику ортопедов, нейрохирургов, челюстно-лицевых хирургов и стоматологов. До 5 % переломов, 20% высоэнергетических травм и, зачастую, плановые ортопедические процедуры, например, спондилодез, приводят к несращениям [1, 2]. Текущий золотой стандарт лечения костных дефектов – аутогенная кость, полученная, прежде всего, из подвздошного гребня пациента или иных локализаций, таких как вертельная зона бедра, бугристость большеберцовой кости [3-5]. Несмотря на свою иммуносовместимость, костный аутотрансплантат может быть взят в ограниченном количестве и вызывать сопутствующую заболеваемость (болезненность) донорского участка [6-8]. Аллогенная и ксеногенная костная ткань – альтернативные биологические материалы для лечения костной ткани [3, 8, 9].

Для достижения биосовместимости материала, отсутствия отторжений при получении костного матрикса, необходимо решить проблему полного удаления антигенов из исходного материала. Однако грубая обработка снижает и потенциальные положительные свойства имплантатов. Для сохранения одного из важнейших свойств костных имплантатов, остеокондукции, необходимо сохранение микроархитектоники кости, заряда ее поверхности, шероховатости и полного удаления клеток костного мозга и жира (чужеродных клеток, включая клетки красного и желтого костного мозга животных). Нативная структура создает подходящую среду для клеточного функционирования и дифференцировки [10]. Децеллюляризация — это техника удаления клеток и иммуногенных веществ из тканей, сохраняя при этом естественный внеклеточный матрикс [11, 12], в процессе которой используется химическое, ферментативное или механическое разрушение. Протоколы децеллюляризации разрабатываются с учетом таких факторов, как плотность ткани, клеточность и наличие липидов, что особенно важно для костной ткани, содержащей жиры, для которой децеллюляризация сочетается со стадией делипидизации [13, 14]. Децеллюляризованный костный матрикс содержит факторы роста, фибронектин, гепаринсульфат, хондроитинсульфат и гиалуроновую кислоту, которые индуцируют дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток в остеобласты [15].

В процессе децеллюляризации происходит некоторое нарушение структуры костного матрикса. Для создания идеальных материалов необходимо стабильное состояние между поддержанием структуры матрикса и удалением клеточного компонента [16], является основной проблемой.

Точная и полная децеллюляризация невозможна, поэтому эффективная децеллюляризация должна максимизировать изъятие клеточных компонентов и генетического материала, сводя к минимуму разрушение структуры матрикса, что позволит сохранить биологическую активность и специфические биомеханические характеристики [17].

Конкретные процедуры децеллюляризации варьируются и могут включать комбинацию физических, ферментативных и химических процессов. Физическая децеллюляризация является наименее разрушительным методом децеллюляризации, при этом большинство компонентов и структуры внеклеточного матрикса остаются нетронутыми после воздействий [18]. В качестве физических методов воздействия применяются УЗ-воздействие (патент РФ №2166252), воздействия центробежной силы (патент РФ №2172104), воздействия магнитного поля (патент РФ №2223104). Однако сама по себе физическая децеллюляризация не может полностью удалить клеточный детрит (фрагменты клеток) из ткани. Часто его используют в сочетании с дополнительными химическими или ферментативными методами [19]. Так, использование ферментных препаратов наряду с другими предлагается для депротеонизации путем ферментации в 2-5% растворе трипсина (патент РФ №2301633) или в 0,01% растворе хемотрипсина (патент РФ №2223104). Среди химических растворителей наибольшей популярностью обладают 6 – 10% растворы перекиси водорода, спиртоэфирные растворы (патент РФ №2166252, патент РФ №2172104, патент РФ №2223104, патент РФ №2377959).

Для подтверждения эффективной децеллюляризации необходимо учитывать как минимум три характеристики, в соответствии с Crapo et al. [20]: а) один миллиграмм обезвоженных децеллюляризированных тканей должен содержать менее 50 нанограммов двухцепочечной ДНК; б) все оставшиеся фракции ДНК должны иметь длину менее 200 пар оснований; в) децеллюляризированные образцы не должны иметь ясного ядра при окрашивании гематоксилином и эозином, а также при окрашивании DAPI.

Помимо количественного определения оставшегося клеточного материала важна оценка макроскопических и микроскопических изменений в структуре, для чего могут быть использованы методы микроскопии [21], микрокомпьютерной томографии [22, 23].

В настоящее время в тканевых банках используют сочетание физических, химических и биологических методов для достижения наилучшего клеточного эффекта. В рамках нашей научной работы ставилась задача разработать эффективный протокол очистки ксеногенной костной ткани, используя сравнительный метод анализа по результатам комплексного исследования костного материала, включая гистологическую и микротомографическую оценки. Микротомографическое исследование – стандартный инструмент для визуализации структуры костной ткани. Однако микро-КТ может служить скрининговым инструментом оценки очистки костной ткани посредством расчета денситометрических показателей межтрабекулярного пространства. В исследовании предложен метод оценки чистоты межтрабекулярного пространства, что ранее не применялось другими исследователями, по крайней мере в известных нам литературных источниках.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования.

Объект исследования, ксеногенная костная ткань бедренных костей крупного рогатого скота в возрасте 24 месяцев, был приобретен на мясокомбинате «Останкино» (Москва, Россия). После транспортировки в охлажденном виде кости хранили при температуре -20°C в морозильной камере MDF-794 (Sanyo, Япония) для поддержания остеоиндуктивного потенциала. Перед очисткой кости были разморожены, спонгиозная кость отобрана и фрагментирована до размеров 10х10х10 мм с использованием ленточной пилы КТ-210 (КТ сервис, Россия).

Дизайн исследования.

Два этапа исследования:

• Сравнение методик первичной очистки (гипертонический, гипотонический растворы и разно концентрированные растворы перекиси водорода в различных сочетаниях);
• Сравнение методик глубокой (вторичной) очистки смесью органических растворителей (этанол-хлороформ, гексан-пропанол) с последующим удалением их вакуумированием в течение 5 часов и очистки с помощью технологии сверхкритической флюидной экстракции.

Режимы первичной очистки.

Две стадии первичной очистки:

• воздействие гипертоническим (7% раствор хлорида натрия (7% р-р NaCl) (Ленреактив, хч, Россия), или гипотоническим раствором (0,5% раствор хлорида натрия (0,5% р-р NaCl), или проточной водой (H₂O прот.) в течение 4 часов при комнатной температуре на орбитальном шейкере PSU-20i (BioSan, Латвия) при 120 оборотах в минуту в вакууме с использованием эксикатора и вакуумного насоса. Объем жидкости к объему материала (V жидкости / V материала) = 10:1;
• воздействие низкоконцентрированным (3%-ым) или высоконцентрированным (6%-ным) раствором перекиси водорода медицинской (H₂O₂) (ОАО «Самарамедпром», Россия) в ультразвуковой ванне (УЗ) ПСБ-12035-05 (ПСБ-Галс, Россия) при температуре 40 °С в течение 8 часов.

Обозначение методики очистки с указанием воздействия указаны в таблице 1.

 

Таблица 1 – Методики очистки ксеногенного костного матрикса

Реагенты  № методики	7%р-р NaCl	0,5% р-р NaCl	H2Oпрот.	3% р-р H2O2+ УЗ	6% р-р H2O2 + УЗ
1-1	+			+
1-2	+				+
2-1		+		+
2-2		+			+
3-1			+	+
3-2			+		+

 

Режимы глубокой очистки.

Глубокая очистка применялась к материалу, очищенному по протоколу, разработанному по результатам первого этапа исследования. Первичная очистка состояла из последовательного воздействия проточной водой (V воды / V материала = 10:1) в течение 4 часов и гипотонического раствора в течение 2 часов на встряхивающем столе при 120 оборотах в минуту в вакууме при комнатной температуре, с последующей обработкой в 3%-ном растворе перекиси водорода в ультразвуке при температуре 40 °С в течение 8 часов. Для глубокой очистки использовались смеси органических растворителей (этанол-хлороформ, гексан-пропанол) с соотношением 50:50 по объему при комнатной температуре в течение 24 часов с последующим удалением их вакуумированием в течение 5 часов или технология сверхкритической флюидной экстракции, проводимая на установке Waters5000 (Waters, США) при давлении 450 Бар, температуре +35°C, скорости потока ск-CO₂ 2±0,5мл/мин в течение 8 часов.

Обозначение методики очистки с реагентами воздействия указаны в таблице 2.

 

Таблица 2 – Методики глубокой очистки ксеногенного костного матрикса

Реагенты  № методики	ск-СО2	Органические растворители
4-1	-	этанол, хлороформ
4-2	-	гексан, пропанол
4-3	+	-

 

Микротомографическое исследование

Сканирование образцов выполнено на рентгеновском микротомографе Bruker SkyScan 1172 (BRUKER BELGIUM, Бельгия) по режиму, указанному, с помощью программного обеспечения SkyScan. На основе полученных теневых проекций произведена реконструкция в программе NRecon по алгоритму Фельдкампа. При предварительном просмотре сечений были выбраны параметры реконструкции и динамический диапазон для достижения оптимальной контрастности изображения.

Изображения объемных моделей образцов получены с помощью программы CTvoх, входящей в пакет программного обеспечения для томографа. Для построения объемных моделей использовался алгоритм MarchingCube, который является алгоритмом построения поверхности на основе модели явного задания шестигранных вокселей, разработанной Лоренсеном и Клайном (1987).

Денситометрическое исследование проведено на тех же образцах при выборе зоны интереса 5х5х5 мм, расположенной в центральной части образца, с помощью программы программа CTAn 1.20.3.0 (рисунок 1).

 

Рисунок 1 – Зона интереса для расчета денситометрических показателей

 

Плотность по шкале Хаунсфилда (HU) была определена для объема куба. Количество измерений на каждого метода очистки – 10. Результаты денситометрии оценивались в соответствии с таблицей 3.

 

Таблица 3 – Диапазон плотности для вещества/ткани

Вещество (ткань)	Диапазон плотности по шкале Хаунсфилда, HU
Воздух	-1000 – -816
Ткань межтрабекулярного пространства	-816 – +301
Минерализованная костная ткань	+314 – +2487

 

Результаты денситометрического исследования представлены в виде соотношения веществ/биоткани в центральной части образцов объемом 5х5х5 мм в % от общего объема, как средние значения по результатам трех измерений.

Степень очистки ксеногенного костного матрикса представлена коэффициентом очистки, рассчитанным по формуле:

К оч. =  .

 

Гистологическое исследование

Все образцы фиксировали в нейтральном формалине, декальцинировали, обезвоживали, заливали в парафин, получали срезы толщиной 4 микрона, окрашивали гематоксилином-эозином и пикросириусом красным. Изучали при стандартной световой, фазово-контрастной и поляризационной микроскопиях в микроскопе Leica DM 4000 B LED (Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Германия) с камерой Leica DFC 7000 T.

Морфологический анализ содержания остеоцитов в костной ткани был основан на характерных морфологических особенностях этих клеток и их специфическом расположении и не требовал дополнительного иммуногистохимического исследования. Остеоциты – основные клетки костной ткани, овальной формы с уплощенными ядрами и многочисленными отростками и лежащие в особых полостях межклеточного вещества - костных лакунах.

Морфометрический анализ содержания костных лакун с оставшимися после обработки клеточными ядрами остеоцитов было подсчитано на 100 тыс. мкм² площади образцов ксенокости в программе ImageJ при увеличении 200x в 10 полях зрения для каждого образца. Данные представлены в виде средних значений и ошибок среднего. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPadPrism 9.0.0. Достоверность различий оценивали с помощью однофакторного анализа ANOVA с тестом множественного сравнения Тьюки. P-значения ≤ 0,05 считались статистически значимыми.

 

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР ¹Н)

Качественное определение остаточных количеств растворителей после финального обезжиривания проводили методом ЯМР 1Н, используя в качестве внутреннего стандарта бензол (спектры ЯМР 1H зарегистрированы на спектрометре «Bruker Advance-400» (BrukerBioSpin GmbH, Германия) (рабочая частота 400 МГц) в C₆D₅H). Образцы для ЯМР готовили путем экстракции матрикса размером 10х7х3 мм в 3 мл бензола в укупоренных виалах в шейкере-инкубаторе без нагревания при скорости вращения 120 rpm в течение 10 суток, центрифугирования и упаривания экстракта в вакууме. Остаток растворяли в 0,6 мл C₆D₅H.В пробирку для ЯМР, содержащую приблизительно 0,4 мл дейтерированного растворителя, добавляли 3 мкл образца экстрагированного раствора.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В соответствии с результатами микротомографического исследования (табл. 4), макроскопических изменений в трабекулярной костной структуре после воздействия в соответствии с указанными выше протоколами очистки, не наблюдалось. Сохранность костной структуры отчетливо подтверждается результатами гистологического исследования при использовании фазово-контрастной и поляризационной микроскопий (табл. 5).

 

Таблица 5 – Результаты томографического исследования

3D реконструкция	Микро-КТ срез	3D реконструкция	Микро-КТ срез
1-1		1-2
2-1		2-2
3-1		3-2

 

У образцов 1-1 и 3-1 костные трабекулы обычной толщины формировали ячеистую сеть, что характерно для нормальной губчатой кости. Во всех остальных образцах присутствовали признаки нарушения микроструктуры и архитектоники костной ткани с увеличением площади межтрабекулярного пространства: костные трабекулы становились тоньше, были более рыхло и параллельно расположены, появлялось много мелких трабекул.

 

Таблица 5 –Микроскопия образцов ксеногенного костного матрикса

№ мет.	Светлопольная микроскопия, Гематоксилин-эозин, увеличение 50x	Поляризационная микроскопия, Пикросириус красный, увеличение 50x	Фазово-контрастная микроскопия, Гематоксилин-эозин, увеличение 100x
1-1
1-2
2-1
2-2
3-1
3-2

 

В соответствии с морфологическими параметрами образцов (табл. 6, 6), очищенных по применяемым методикам, в незначительной части лакун сохранялись остеоциты, мембраны адипоцитов (жировых клеток) костного мозга, в одном из образцов наблюдались кровеносные сосуды.

 

Таблица 6 – Морфологические параметры образцов ксеногенной костной ткани

№ мет.	Костная структура	Расположение трабекул	Трабекулы	Жировые клетки/оболочки жировых клеток	Кровеносные сосуды
1-1	сохранена	нормальное	нормальные	сохранены	нет
1-2	сохранена	рыхло, параллельно расположенные	тонкие	сохранены	есть
2-1	сохранена	рыхло	мелкие	сохранены	нет
2-2	сохранена	в некоторых участках рыхло, есть параллельно расположенные	тонкие	сохранены	нет
3-1	сохранена	нормальное	нормальные	сохранены	нет
3-2	сохранена	рыхло	тонкие	сохранены	нет

 

Таблица 7 – Морфологический анализ содержания остеоцитов

№ мет.	% содержания костных лакун с оставшимися после обработки ядрами остеоцитов от общего числа лакун в образце	Кол-во костных лакун с оставшимися ядрами остеоцитов в костной ткани (шт/ на 100 тыс. мкм2 образца)
1-1	34,0 ± 4,1	13,6 ± 1,7
1-2	7,7 ± 1,1	3,3 ± 0,5
2-1	25,9 ± 3,7	10,7 ± 1,5
2-2	7,7 ± 1,5	3,3 ± 0,7
3-1	12,6 ± 2,3	4,5 ± 0,8
3-2	5,2 ± 1,3	2,8 ± 0,7

 

Т.е. при воздействии гипертонического раствора хорошо сохраняются костные трабекулы, которые формируют ячеистую сеть, характерную для нормальной губчатой кости, однако гипертонический раствор хуже остальных влияет на вымывание остеоцитов. Гипертонический раствор отделяет ДНК от белков [24, 25]. Гипотонические растворы могут легко вызывать лизис клеток с помощью простых осмотических эффектов с минимальными изменениями молекул матрикса и архитектуры, в соответствии с литературными данными [25]. Однако при 4-часом воздействии гипотоническим раствором происходят незначительные нарушения структуры: костные трабекулы становились тоньше, были более рыхло и параллельно расположены. Все это в итоге может привести к снижению костной плотности, упругости и эластичности с последующим повышением ломкости кости. В соответствии с литературными данным гипо- и гипертонические растворы эффективно лизируют клетки, но не эффективно удаляет клеточные остатки [20]. Воздействие проточной водой хорошо сохраняет костные трабекулы, оставляя наименьшее количество остеоцитов в межтрабекулярном пространстве. Сохранность жировых клеток в результате первичной очистки в водных растворах указывает на недостаточно эффективную делипидизацию и требует дополнительных методов очистки.

Предложенный скрининговый метод определения коэффициента очистки по денситометрической плотности, определенной по результатам микро-КТ, дает возможность быстро оценить степень очистки межтрабекулярного пространства. Это грубый метод и не может быть использован в качестве единственного метода контроля, однако он наименее трудоемкий, наиболее быстрый и может быть использован для первичного скрининга в процессе очистки. Межтрабекулярное пространство, заполненное ретикулярной и жировой тканью, освобождается в процессе очистки, заполняясь воздухом. При расчете коэффициента очистки минерализованный компонент кости не учитывался, поскольку его количество в объеме зависит от удаленности от надкостницы и уменьшается от периферии к костномозговому каналу. В соответствии с расчетным по денситометрическим показателям коэффициентом очистки, межтрабекулярное пространство костной ткани после воздействия проточной водой и гипо- и гипертоническими растворами заполнено в меньшей степени воздухом и в большей – иными веществами (возможно, клеточными остатками ретикулярной и жировой тканей) (табл. 8).

 

Таблица 8 – Соотношение (%) веществ/биотканей в объеме образцов и коэффициент очистки

Методика Вещество/биоткань	1-1	1-2	2-1	2-2	3-1	3-2
воздух	17,4	18,9	12,0	27,7	8,5	21,9
ткань межтрабекулярного пространства	72,1	56,5	73,1	66,5	79,0	66,6
минерализованный компонент кости	10,5	24,6	14,9	5,8	12,6	11,6
коэффициент очистки	0,24±0,05	0,33±0,06	0,16±0,04	0,42±0,06	0,11±0,04	0,33±0,06

 

С связи с необходимостью удаления лизисных клеточных остатков необходимо дополнительное воздействие. Физические методы очистки ткани в определенной степени эффективны и обладают преимуществом перед другими методами в низких иммунных реакциях ткани после их применения за счет отсутствия воздействия химических реагентов, которые могут оставаться в следовых количествах после использования в методике очистки. Они применяются для изменения физических характеристик ткани, разрушения клеточной мембраны, вызывания лизиса клеток и, наконец, удаления клеток и другого содержимого [26].

УЗ-воздействие может привести к лизису клеток, но чаще используется для облегчения химического воздействия и удаления клеточного материала. Известно, что перекись водорода, взаимодействуя с липидами клеточных мембран, повреждает их, инактивирует и устраняет широкий спектр микроорганизмов. Совместное взаимодействие перекиси водорода и ультразвука увеличивают эффективность очистки, которая зависит от концентрации перекиси водорода. Обработка ультразвуком приводит к нарушению целостности клеточной мембраны, образованию пор и лизису клеток. Как следствие, увеличивается проницаемость мембраны, что облегчает и способствует проникновению перекиси вглубь матрикса. При обработке костного матрикса 6% раствором перекиси водорода в остеоцитах ядер наблюдается в несколько раз меньше, чем при обработке в 3% растворе, следовательно, его иммуногенность ниже, но общая костная структура более рыхлая, трабекулы становятся тоньше и реже, что подтверждается данными гистологического и микротомографического исследований. Таким образом, использование 6% раствора перекиси водорода вызывает деструкцию и нежелательно с точки зрения сохранности архитектоники.

На основании результатов первого этапа исследования, протокол первичной очистки включает последовательное воздействие проточной водой в течение 4 часов, гипотоническим раствором в течение 2 часов и 3%-ным раствором перекиси водорода в ультразвуке в течение 8 часов. При использовании указанного протокола сохраняется нормальная костная структура, однако также сохранены мембраны адипоцитов (жировых клеток) костного мозга, количество остеоцитов с ядрами ̴ 10%. Коэффициент очистки составляет 0,68±0,06.

Следующим этапам работы было исследование воздействия органических растворителей (смеси этанола с хлороформом и гексана с пропанолом) и воздействия сверхкритической флюидной экстракции диоксидом углерода на ксеногенный костный матрикс, подвергнутых первичной очистке.

Эффективность использования всех этих методов подтверждается результатами томографического и гистологического исследований: сохранность микроархитектоники (костные трабекулы формируют характерную для нормальной губчатой кости ячеистую сеть, костный матрикс имеет нормальную тонковолокнистую структуру), лизис клеток (в лакунах сохранено меньше 10 % остеоцитов с ядрами, остальные лакуны пустые) и полное удаление клеточных остатков (мембраны адипоцитов костного мозга отсутствуют). На рисунках 2, 3 приведены результаты томографического и гистологического исследований для образца, очищенного по методике 4-3. Результаты исследований образцов, очищенных по методике 4-1 и 4-2 представляют собой аналогичную картину.

Коэффициент очистки ксеногенного костного матрикса после глубокой очистки при воздействии органических растворителей и сверхкритической флюидной экстракции (4-1, 4-2, 4-3), в соответствии с результатами томографического исследования (рис. 3) составляет ~ 0,90±0,07 для образцов, очищенных по методике 4-1, ~ 0,92±0,04 для образцов, очищенных по методике 4-2 и ~ 0,91±0,05 для образцов, очищенных по методике 4-3, что значительно превышает коэффициент очистки после первичного воздействия.

а)	б)
Рисунок 2 – Результаты томографического исследования образца, очищенного по методике 4-3: а) 3D реконструкция; б) микро-КТ срез

 

а)	б)	в)
Рисунок 3 – Микроскопия образца, очищенного по методике 4-3: а) светлопольная, гематоксилин-эозин, увеличение 50x; б) поляризационная, пикросириус красный, увеличение 50x; в) фазово-контрастная, гематоксилин-эозин, увеличение 100x

 

Органические растворители оказывают воздействие на лизис клеток путем дегидратации, солюбилизации и удаления липидов, эффективно удаляют клетки из плотных тканей и инактивирует пирогены. Однако растворители способны сшивать и осаждать белки, включая коллаген [20]. При химическом воздействии на костную ткань органическими растворителями возможно снижение некоторых факторов роста, биологической активности полученных матриксов в большинстве случаев и снижение биосовместимости, увеличение частоты отрицательного иммунного ответа из-за остаточных реагентов [26].

Следовые количества реагентов действительно присутствуют после удаления органических растворителей вакуумированием, согласно результатам спектроскопии ядерного магнитного резонанса, что может повышать иммуногенность. В спектрах ЯМР ¹H образцов, обработанных органическими растворителями, обнаружены химические сдвиги, которые соответствуют следовым количествам этанола, пропанола, гексана (рис.4) [27]. На рис.4а представлен спектр ЯМР ¹H вытяжки из матрикса, очищенного смесью этанола (CH₃CH₂OH) и хлороформа (CHCl₃). В соответствии с [27] при использовании бензола (C₆D₅H) в качестве внутреннего стандарта химические сдвиги групп этанола приходятся на 0,50; 0,96 и 3,34м.д., химические сдвиги групп хлороформа – на 6,15 м.д. Последний сдвиг на спектре не обнаружен. Другие сдвиги присутствуют на спектре с незначительным смещением.

На рис.4б представлен спектр ЯМР ¹H вытяжки из матрикса, очищенного смесью гексана (CH₃(CH₂)₄CH₃) и пропанола ((CH₃)₂CHOH). В соответствии с [27] при использовании бензола в качестве внутреннего стандарта химические сдвиги групп пропанола приходятся на 0,95 и 3,67 м.д.; химические сдвиги групп гексана – на 0,89 и 1,24 м.д. Сдвиг, характерный для гексана, обнаружен при 1,27м.д., сдвиги, относящиеся к пропанолу, при 0,95 и 3,64 м.д. Обнаруженные сдвиги свидетельствуют о следовых количествах органических растворителей на поверхности матриксов.

На рис.4в представлен спектр ЯМР ¹H вытяжки из матрикса, очищенного сверхкритической флюидной экстракцией. На спектре обнаружены единственные сдвиги малой интенсивности, синглет, в той же области, где находится вода. Сверхкритический диоксид углерода удаляет остатки клеток при пропускании через ткани с контролируемой скоростью, аналогичной сушке в критической точке, для удаления клеток при минимальном изменении механических свойств матрикса [28]. При экстракции в СО₂ удаление липидов из ткани на 14% эффективнее, чем традиционная экстракция липидов [29]. В литературе сообщается о возможности ск-СО₂ служить стерилизующим агентом [28, 30], однако этот эффект применительно к костной ткани требует дополнительного изучения.

 

а)

б)

в)

Рисунок 4 – ЯМР-спектры экстрактов из образцов, очищенных: а) этанол + хлороформ (4-1); б) гексан + пропанол (4-2); в) ск-СО2 (4-3)

 

Технология сверхкритической флюидной экстракции высокоэффективно очищает костный матрикс и не оставляет следов органических растворителей, остаточное количество которых могло бы потребовать контроля в процессе производства. По литературным данным, при обработке в ск-СО₂ содержание липидов снижается до 0,1% [29]. Оставшийся после воздействия углекислый газ является естественным компонентом тканей, не является токсичным и легко выводится.

Таким образом, эффективный протокол очистки, следующий:

• воздействие проточной водой 4 часа;
• воздействие 0,5%-ным раствором NaCl часа;
• воздействие 3%-ным раствором H₂O₂ при УЗ-воздействии в течение 8 часов;
• воздействие сверхкритическим CO₂ 8 часов при давлении 450 Бар, температуре +35°C.

В нашей работе очистка костного матрикса флюидной экстракцией является эффективной завершающей стадией протокола очистки. При полной очистке межтрабекулярного пространства костной ткани от клеточного компонента наблюдается полная сохранностью микро- и макроструктуры ксеногенного костного матрикса.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе выполнения работы был выбран наиболее эффективный протокол очистки ксеногенной спонгиозной костной ткани с использованием сочетания физического и химического воздействий. Подобраны параметры, реагенты и методы воздействий, позволяющие провести полную очистку межтрабекулярного пространства от кровеносных сосудов, клеточных элементов, сохранив микроархитектонику нативной костной ткани, что подтверждается гистологическим и томографическим исследованиями с учетом коэффициента очистки, рассчитанного на основе денситометрической плотности.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Об авторах

Дмитрий Владимирович Смоленцев

Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова

Автор, ответственный за переписку.
Email: SmolentsevDV@cito-priorov.ru
ORCID iD: 0000-0001-5386-1929
SPIN-код: 3702-1955
Scopus Author ID: 5720113218
ResearcherId: AAI-2081-2020

Научный сотрудник, Лаборатории разработки и испытания медицинских изделий и материалов

Россия, Москва

Юлия Сергеевна Лукина

Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова

Email: lukina_rctu@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0121-1232
SPIN-код: 2814-7745

канд. тех. наук

Россия, Москва

Леонид Львович Бионышев-Абрамов

Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова

Email: sity-x@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-1326-6794
Россия, Москва

Наталья Борисовна Сережникова

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова

Email: natalia.serj@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4097-1552
SPIN-код: 2249-9762

канд. биол. наук

Россия, Москва

Максим Геннадьевич Васильев

ФГБУ «НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова» Минздрава России

Email: VasilevMG@cito-priorov.ru

К.м.н., старший научный сотрудник

Список литературы

Дополнительные файлы