FLUORESCENCE DIAGNOSIS AND PHOTODYNAMIC THERAPY OF MALIGNANT GLIOMAS IN RATS

Full Text

Лечение злокачественных глиом головного мозга составляет одну из наиболее сложных задач в нейроонкологии. На современном этапе наиболее эффективным является комбинированный подход к лечению злокачественных глиом, включающий хирургическое удаление опухоли, лучевую терапию, химиотерапию, а также ряд Для корреспонденции: Смирнова Зоя Сергеевна - д-р мед. наук, проф., зав. лаб. экспериментальной химиотерапии НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ. 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24; e-mail: smirnova_z@mail.ru. новых методов лечения: иммунотерапию, антиангиоген-ную, фотодинамическую терапию (ФДТ) [1]. Основными факторами, влияющими на прогноз больных со злокачественными глиомами, являются: гистологическая степень злокачественности опухоли, возраст пациентов, тяжесть состояния больных при поступлении в клинику и после операции, а также радикальность хирургического вмешательства [2]. Главной целью оперативного вмешательства является удаление максимально возможного объема опухоли и постановка точного гистологического диагноза. Лучевая терапия является одним из методов послеоперационной терапии и в ряде случаев приводит к увеличению продолжительности жизни, в особенности пациентов моложе 65 лет. Лучевую терапию рекомендуют проводить больным с анапластическими астроцитомами и глиобластомами. Общепринятая фракционированная лучевая терапия выполняется с использованием высокой энергии фотонных лучей, генерированных магнитными ускорителями, или же используется телегамма-терапия. Химиотерапевтическое лечение в сочетании с предварительным удалением опухоли и послеоперационной лучевой терапией позволяет повысить одно- и двухлетнюю выживаемость больных со злокачественными глиомами, особенно больных с анапластическими астроци-томами [3]. В то же время применение химиотерапии для лечения опухолей центральной нервной системы (ЦНС) связано с большими трудностями, обусловленными наличием гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и низкой чувствительностью глиом к большинству химиотерапевтических агентов [4]. Наиболее эффективными препаратами для лечения опухолей мозга считаются производные нитрозомоче-вины, способные проникать через ГЭБ [5]. Применяют также метилирующие агенты (прокарбазин и декарба-зин), платиновые соединения (карбоплатин и цисплатин), алкалоиды барвинка (винкристин и винбластин). Последние 5-7 лет в лечении глиом активно используется темодал. По данным литературы, средняя продолжительность жизни больных с глиобластомами после хирургического удаления, послеоперационной лучевой и химиотерапией составляет 7-12 мес [6]. ФДТ является относительно новым методом в лечении злокачественных опухолей, основанным на способности фотосенсибилизаторов (ФС) селективно накапливаться в ткани опухоли и при локальном воздействии лазерного облучения определенной длины волны, совпадающего с пиком поглощения препарата, генерировать синглетный кислород и другие активные радикалы, оказывающие токсический эффект на опухолевые клетки. Высокая избирательность поражения опухоли при ФДТ позволяет минимально травмировать окружающие здоровые ткани, что обусловливает высокий терапевтический результат лечения. Метод ФДТ выгодно отличается от традиционной терапии отсутствием тяжелых местных и системных осложнений [7]. Кроме прямого цитотоксического воздействия, при ФДТ важную роль в деструкции новообразования играют также нарушение кровоснабжения опухоли за счет повреждения эндотелия кровеносных сосудов опухолевой ткани; цитокино-вые реакции, стимуляция продукции фактора некроза опухоли, активация макрофагов, лейкоцитов и лимфоцитов. Кроме того, важным при проведении ФДТ является достаточная оксигенация тканей, необходимая для образования синглетного кислорода. Эффективность фотодинамического повреждения биологической ткани определяется, главным образом, уровнем накопления фотосенсибилизатора, его локализацией в клетке, фотохимической активностью (квантовым выходом генерации синглетного кислорода или свободных радикалов). Еще одним направлением современной нейроонкологии является флюоресцентная диагностика (ФД), заключающаяся в определении границ опухоли с помощью флюоресценции фотосенсибилизаторов. Интерес к флюоресцентному методу диагностики повысился в последние 10 лет в связи с появлением нового соединения для ФД и ФДТ - 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК), являющейся предшественником фотоактивно- Таблица 1 Эффективность фотодинамической терапии глиомы С6 у крыс Группа Плотность мощности, мВт/см2 Время облучения, мин СПЖ, дни УПЖ, % Медиана выживаемости, дни Контроль — — 20,4±3,1 — — Тиосенс 100 20 29,0±2,9 42* 29 200 20 25,1±3,4 23 25 Фотосенс 100 20 23,3±2,5 14 23 200 20 22,4±4,4 10 23 Примечание. * - р < 0,05 по отношению к контрольной группе. Здесь и в табл. 2, 3: СПЖ - средняя продолжительность жизни. го протопорфирина IX (ПП-9). Чувствительность ФД с 5-АЛК при различной локализации опухолей составляет более 90%, а селективность накопления выше, чем у многих других ФС. В нашей работе мы изучали возможность применения при комбинированном лечении опухолей головного мозга ФДТ с двумя новыми отечественными фотосенсибилизаторами, отвечающими всем требованиям, предъявляемым оптимальному фотосенсибилизатору, - фо-тосенсом и тиосенсом, а также аласенсом, являющимся структурным аналогом 5-АЛК. Материал и методы Работа выполнена на половозрелых крысах породы Wistar массой 200-220 г. В работе использовали глиому С6, полученную у крыс породы Wistar путем повторного введения нитрозометилмочевины. По гистологическому строению глиома классифицирована как анапластиче-ская астроцитома, которая имеет сходство с глиомой человека. Глиому С6 перевивали интракраниально по 400 • 103 опухолевых клеток. Фотосенс, который представляет собой смесь натриевых солей сульфированного фталоцианина алюминия (от ди- до тетразамещенного), синтезированный во ФГУП ГНЦ НИОПИК, обладает интенсивной полосой поглощения в красной области спектра с максимумом в водном растворе в области 678±2 нм. Фотосенс использовали в виде 0,2% раствора для инъекций 50 мл и вводили внутривенно однократно в дозе 2 мг/кг через 6 дней после перевивки опухоли и за 24 ч до проведения ФДТ. Тиосенс, представляющий собой тетра-3-фенилтио-фталоцианин гидроксиалюминия, не растворимый в воде, синтезирован во ФГУП ГНЦ НИОПИК. Липосомаль-ную дисперсию тиосенса, разработанную в лаборатории лекарственных форм ФГБУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, вводили внутривенно в дозе 3 мг/кг на 6-й день после перевивки опухоли за 24 ч до проведения ФДТ. Электронный спектр поглощения раствора вещества содержит максимумы поглощения 717±4 и 648±4 нм. Препарат Аласенс, являющийся структурным аналогом 5-АЛК, разработанный во ФГУП ГНЦ НИОПИК и имеющий максимум поглощения в спектральном диапазоне 635 нм, вводили внутривенно в дозе 100 мг/кг за 3 ч до оперативного вмешательства. Возбуждение флюоресценции тиосенса осуществляли лазером длиной волны 720 нм, а фотосенса -632 нм. Лазерное облучение проводили в дозах 120 и 240 Дж/см2. Удаление опухоли проводили после краниотомии 4 х 5 мм в области теменной кости. Опухоль визуализировали либо при обычном освещении, либо после введения 5-АЛК с использованием специальных светодиодных источников длиной волны 404±2 и 440±2 нм. Рис. 1. Патоморфологическая картина глиомы С6 через 24 ч после ФДТ с фотосенсом. Окраска гематоксилином и эозином. Контроль за объемом резецируемой опухоли проводили спектрально-флюоресцентным методом по интенсивности флюоресценции фотосенса и тиосенса в ложе опухоли с использованием спектроанализатора ЛЭСА-Биоспек. При патоморфологическом исследовании гистологические препараты готовили по стандартной методике. В качестве красителей использовали гематоксилин и эозин. Критериями противоопухолевого эффекта служило увеличение продолжительности жизни (УПЖ) опытных крыс по сравнению с контрольными животными и патоморфологическое исследование. Кривые выживаемости Каплана-Мейера оценивали с помощью лог-рангового критерия. Результаты и обсуждение На первом этапе нашего исследования была изучена эффективность отечественных фотосенсибилизаторов фо-тосенса и тиосенса при ФДТ глиомы С6 в монотерапии. Облучение проводили поверхностно через твердую мозговую оболочку. Использовались различные режимы облучения: 100 мВт/см2 в течение 20 мин (120 Дж/см2) или 200 мВт/см2 в течение 20 мин (240 Дж/см2). Из представленных в табл.1 данных следует, что ти-осенс более эффективен, чем фотосенс при ФДТ глиомы С6 в монотерапии (максимальное УПЖ составляет 42 и 14% соответственно). Это в первую очередь связано с тем, что фотосенс вызывает более выраженный отек головного мозга. Так, после облучения, несмотря на введение дексаметазона, от отека мозга в первые сутки погибали 20-30% крыс. В связи с этим не удалось получить статистически значимых различий выживаемости крыс после ФДТ с фото-сенсом. Таблица 2 Эффективность ФДТ с использованием тиосенса и фотосенса на глиоме С6 после декомпрессионной краниотомии Группа Плотность мощности, мВт/см2 Время облучения, мин СПЖ, дни УПЖ, % Медиана выживаемости, дни Кон трольная — — 20,4±3,1 — Тиосенс 100 20 31,5±5,0 54* 32 Фотосенс 100 20 24,6±3,3 20 25 При патоморфологическом исследовании опухолевой ткани после ФДТ с фотосенсом и тиосенсом выявлен некроз и апоптоз, разрушение сосудов с кровоизлияниями и тромбоз сосудов в результате деструктивного васкулита. В окружающей ткани отмечался некроз, отек, полиморфно-ядерно-лейкоцитарная инфильтрация, а также пролиферация глиальных элементов и эндотели-оцитов, острая воспалительная реакция и репаративные изменения в нервной ткани (рис. 1, 2). С целью уменьшения гибели крыс от отека головного мозга на следующем этапе для снижения внутричерепного давления (ВЧД) выполняли декомпрессионную краниотомию размером 4 х 5 мм. Представленные в табл. 2 данные показывают, что при ФДТ с тиосенсом в дозе 3 мг/кг глиомы С6 после краниотомии при плотности мощности лазерного излучения 100 мВт/см2 УПЖ составляет 54%, а при ФДТ с фотосенсом - 20%, медиана выживаемости - 32 и 25 сут соответственно. Учитывая данные литературы, свидетельствующие о значительной корреляции между объемом резецируемой глиомы и продолжительностью жизни пациентов, мы на 7-й день опыта удаляли максимально возможный объем ткани глиомы С6. Контроль за объемом резецируемой глиомы проводили спектрально-флюоресцентным методом по интенсивности флюоресценции фотосенса Таблица 3 Эффективность ФДТ с использованием фотосенса, тиосенса, аласенса после удаления глиомы С6 у крыс Группа СПЖ, дни УПЖ, % Медиана выживаемости, дни Контрольная группа 20,4±3,1 — Хирургическое удаление опухоли 24,7±3,7 21 25 Хирургическое удаление опухоли под контролем флюоресценции ПП-9 27,1±3,6 33 27 Интраоперационная ФДТ с фотосенсом 24,9±4,1 22 25 Интраоперационная ФДТ с тиосенсом 34,3±4,7 68* 34 Интраоперационная ФДТ с аласенсом 29,8±4,2 46* 30 и тиосенса в ложе опухоли, которые вводили за 24 ч до операции. Для сравнения интенсивность флюоресценции измеряли в коже уха и лапы (области, где отсутствует шерсть). Флюоресцентные исследования показали, что без хирургического вмешательства и при неполном удалении опухоли наблюдается интенсивная флюоресценция. Однако и при радикальных операциях наблюдается незначительная интенсивность флюоресценции в ложе опухоли, а при гистологическом исследовании удается обнаружить отдельные небольшие фокусы опухолевых клеток. Так, было показано, что хирургическое удаление ткани глиомы С6 радикально выполнено у 7 (43,8%) крыс из 16. В табл. 3 представлены данные по выживаемости крыс после хирургического удаления опухоли при обычном освещении, а также с использованием фиолетового света под контролем флюоресценции аласенса, который вводили в дозе 100 мг/кг за 3 ч до проведения операции. Из представленных в табл. 3 данных видно, что удаление глиомы С6 под контролем флюоресценции после введения аласенса приводит к увеличению продолжительности жизни оперированных крыс с 21% (удаление опухоли при обычном освещении) до 33%. Интраоперационная ФДТ с фотосенсом не превышает эффективности резекции при обычном освещении, что, вероятно, связано с выраженным повышением ВЧД и гибели крыс от отека мозга. Тем не менее, учитывая результаты патоморфологического исследования, можно говорить об эффективности этого фотосенсибилизатора. Комбинированное лечение глиомы С6 с использованием интраоперационной ФДТ с тиосенсом привело к статистически значимому увеличению выживаемости подопытных крыс по сравнению с контрольными, УПЖ составляет 68%, а медиана выживаемости - 34 дня. Интраоперационная ФДТ с аласенсом после резекции глиомы С6 вызывает 46% = УПЖ, медиана выживаемости составляет 30 дней. В нашей работе мы изучали эффективность применения при комбинированном лечении опухолей головного мозга двух новых отечественных фотосенсибилизаторов - фотосенса и тиосенса, а также аласенса, являющегося структурным аналогом 5-АЛК. Ранее с помощью спектрально-флюоресцентного метода нами было показано, что эти фотосенсибилизаторы селективно накапливаются в опухолевой ткани, а индекс селективности достигает 12-13. Кроме того, был установлен оптимальный срок введения препаратов после перевивки опухоли (6-й день опыта за 24 ч до проведения ФДТ), а также наиболее эффективные дозы фотосенсибилизаторов и режимы лазерного облучения. Показано, что ФДТ с фотосенсом в монотерапии при лазерном облучении через краниотомическое отверстие приводит к значительной гибели животных от отека мозга. Послеоперационный отек мозга описывается во многих экспериментальных и клинических исследованиях. Одним из возможных факторов, влияющих на развитие отека мозга после ФДТ, является гипертермия (Laws E., 1981). В связи с вышесказанным эффективность ФДТ в монотерапии оценивали по патоморфологическому критерию. При данном исследовании после ФДТ выявлен некроз и апоптоз, разрушение сосудов с кровоизлияниями и тромбоз сосудов в результате деструктивного васкули-та. Такую же патоморфологическую картину описывает L. Lilge и соавт [2], которые изучали in vivo влияние ФДТ с использованием пяти различных фотосенсибилизаторов на патоморфоз карциномы VX2 кроликов. Для снижения ВЧД после ФДТ была использована декомпрессионная краниотомия, что позволило повысить эффективность ФДТ с тиосенсом до 54% УПЖ, а с фотосенсом до 20% УПЖ. Таким образом, статистически значимые различия выживаемости получены для крыс после ФДТ только с использованием тиосенса. На следующем этапе была изучена эффективность хирургического удаления глиомы С6 при обычном освещении, а также под контролем флюоресценции ПП-9 после введения аласенса. Получено увеличение продолжительности жизни опытных животных с 21 до 33%. Радикальность удаления опухоли подтверждалась спектрально-флюоресцентным методом. Кроме того, установлено, что дополнительная интраоперационная ФДТ значительно повышает эффективность хирургического лечения. Максимального значения УПЖ (68%) было достигнуто при комбинированном лечении глиомы С6 с использованием в качестве фотосенсибилизатора тиосенса. Незначительное увеличение продолжительности жизни крыс после интраоперационной ФДТ с фотосенсом связано с развитием основного побочного эффекта - отека мозга. С нарастающим ВЧД при использовании фотосенса не удалось справиться даже после декомпрессионной краниотомии. Однако у человека можно провести более обширную декомпрессионную краниотомию, чем у крысы, поэтому, учитывая высокую эффективность ФДТ с фотосенсом в отношении глиом, выявленную при патоморфологическом исследовании, этот фотосенсибилизатор был рекомендован для клинических испытаний. Заключение В результате экспериментальных исследований нами показана высокая эффективность комбинированного лечения глиомы С6 крыс с использованием интраопераци-онной ФДТ с отечественными фотосенсибилизаторами. Подготовлен протокол клинических испытаний ФДТ с фотосенсом при опухолях головного мозга. В дальнейшем планируется продолжить углубленное изучение интраоперационной ФДТ на других моделях опухолей головного мозга с целью передачи тиосенса на клинические испытания.

About the authors

I. Yu Kubasova

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center of the Russian Academy of Medical Science

Z. S Smirnova

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center of the Russian Academy of Medical Science

Email: smirnova_z@mail.ru

K. V Ermakova

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center of the Russian Academy of Medical Science

L. M Borisova

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center of the Russian Academy of Medical Science

M. P Kiseleva

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center of the Russian Academy of Medical Science

N. A Oborotova

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center of the Russian Academy of Medical Science

G. A Meerovich

A.M.. Prokhorov General Physics Institute of the Russian Academy of Science

V. M Derkacheva

FSUE «SSC» NIOPIK

References

Supplementary files