Characteristics of lymphocyte subpopulations intratumoral ovarian cancer

Full Text

Рак яичника составляет 30% всех онкологических заболеваний женской репродуктивной системы и имеет самые высокие показатели смертности, что связано с поздней диагностикой заболевания. География распространения опухоли неоднородна и варьирует от менее чем 2 новых случаев на 100 тыс. женщин в большинстве стран Юго-Восточной Азин и Африки до более 15 случаев в Северной и Восточной Европе [1]. Распространенность заболевания в Россиив 2013 г. составила 68,1 на 100 тыс. населения, для сравнения - этот же показатель в 2003 г. - 49,5. Количество больных с впервые установленным диагнозом рака яичника в Российской федерации в 2013 г. достигло 12 845, летальность в течение года с момента установления диагноза - 23,7% [2]. По сводным данным популяционных раковых регистров стран Европы, 5-летняя общая выживаемость при раке яичника не превышает 35%, а 65% больных умирают, не дожив до этого срока, и применяемые методы лечения оказываются неэффективными у 2 из 3 больных. Большая часть зарегистрированных летальных исходов рака яичника характеризуется наличием серозного гистологического типа опухоли, что диктует необходимость для улучшения результатов лечения исследовать биологические особенности опухоли. Интересным и инновационным является направление, связанное с изучением механизмов противоопухолевого иммунитета. L. Zang и N.Matsushita [3, 4] в 2003 г. впервые независимо друг от друга сообщили об увеличении показателей общей и безрецидивной выживаемости при инфильтрации опухоли CD3- н CD8+-лимфоцитами. В свою очередь T. Curiel [5] в 2004 г. и Е. Sato [6] в 2005 г. заявили об отрицательном влиянии на прогноз серозного рака яичника высокой концентрации СD4+CD25+-лимфоцитов в опухоли. Прогресс этого направления связан с углубленным исследованием субпопуляций лимфоцитов, присутствующих непосредственно в ткани опухоли, так называемых интратуморальных лимфоцитов. Интратуморальные инфильтраты состоят из Т-лимфоцитов, макрофагов, В-лимфоцитов и естественных киллеров (NK-клетки). Различными исследовательскими сообществами отмечена интересная особенность: Т-лимфоциты способны проникать в зоны сплошного опухолевого роста и осуществлять прямой лизис опухолевых клеток путем выделения литических гранул и цитокинов. Эти лимфоциты названы туморпенетрирующими [7]. Установлено, что клеточные инфильтраты эпителиальных опухолей яичников представлены в основном CD8- лимфоцитами [8]. CD8+-лимфоциты - это функционально разнородная группа иммунокомпетентных клеток. Они могут быть цитотоксическими/супрессорными лимфоцитами и NK-клетками. Несмотря на такое многообразие функций, именно за этими клетками закреплен статус эффекторов иммунного противоопухолевого ответа, что выражается в возможности литического воздействия на опухолевые клетки. Выявлено, что количество CD8+-лимфоцитов значительно выше в образцах рака яичника по сравнению с доброкачественными опухолями [8]. Xhanaa El-A Hecal и соавт. [9] в 2004 г. выявили, что CD8+-лимфоциты н макрофаги являются главными компонентами моно- нуклеарных инфильтратов при раке яичника. Средний уровень CD8+-лимфоцитов и макрофагов в образцах ткани рака яичника был достоверно выше по сравнению с доброкачественными опухолями (р = 0,00009 и р = 0,006 соответственно). В числе интратуморальных лимфоцитов также обнаружены субпопуляции зрелых Т-клеток (CD3+), Т-киллеров (CD8+), Т-хелперных/индукторных клеток (CD4+) и активированных Т-клеток (CD25+). В CD25+-популяцию входят и регуляторные Т-клетки. Подобные работы проведены при раке желудка, а клиническая значимость инфильтрации опухоли CD8+Т-лимфоцитами убедительно доказана прн раке молочной железы [10]. Противоопухолевая активность Т-цитотоксических клеток зависит от ряда факторов, включая иммунофенотипические особенности новообразования. Это обусловлено тем, что Т-лимфоциты распознают опухольассоцииро- ванные антигены в контексте молекул гистосовместимости I и II классов. Утрата этих молекул часто наблюдается в процессе опухолевой прогрессии и ведет к неэффективному распознаванию опухолевых антигенов Т-клетками. Другой причиной неэффективности Т-цитотоксических клеток может являться супрессорное влияние, оказываемое на них Т-регуляторными клетками (CD4CD25), специфическим маркером которых является FOXP3. Таким образом, звенья противоопухолевого иммунитета при серозном раке яичника до настоящего времени мало изучены. Такая ситуация побуждает к продолжению поиска критериев, позволяющих с большей точностью определять группы больных с неблагоприятными прогностическими факторами для проведения более адекватного адъювантного лечения, чтобы иметь возможность влиять на прогноз, который на сегодняшний день в большинстве случаев является фатальным. Цель исследования - изучение состава интратуморальных лимфоцитов в ткани серозной аденокарциномы яичника. Материал и методы В исследование включили 27 больных с гистологически верифицированной серозной аденокарциномой яичника, получавших лечение в НИИ КО Зависимость инфильтрации ТПЛ от степени дифференцировки опухоли Степень Инфильтрация Всего дифференцировки слабая умеренная н выраженная абс. % абс. % абс. % CD45+ (р = 0,6) Высокая 2 66,7 1 33,3 3 100 Умеренная 3 37,5 5 62,5 8 100 Низкая 7 31,8 15 68,2 22 100 CD7+ (р = 0,6) Высокая 1 33,3 2 66,67 3 100 Умеренная 5 62,5 3 37,5 8 100 Низкая 10 45,5 CD3+ (р 12 = 0,01) 54,5 22 100 Высокая 3 100 0 0 3 100 Умеренная 6 75,0 2 25,0 8 100 Низкая 7 31,8 CD8+ (р 15 = 0,15) 68,2 22 100 Высокая 3 100,0 0 0 3 100 Умеренная 6 75,0 2 25,0 8 100 Низкая 11 50,0 11 50,0 22 100 CD4+ (р = 0,4) Высокая 2 66,7 1 33,3 3 100 Умеренная 7 87,5 1 12,5 8 100 Низкая 14 63,6 8 36,4 22 100 CD20+ (р = 0,7) Высокая 1 33,3 2 66,7 3 100 Умеренная 3 37,5 5 62,5 8 100 Низкая 11 50,0 11 50,0 22 100 CD56+ (р = 0,8) Высокая 0 0 2 100,0 2 100 Умеренная 3 21,4 4 78,6 3 100 Низкая 3 25,0 9 75,0 11 100 РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН с 2006 по 2008 г. Возраст больных варьировал от 26 до 77 (медиана 50) лет. Больные с I стадией составили 11,3% (n = 3), со II - 3,7% (n = 1), с III - 77,7% (n = 21), с IV - 7,4% (n = 2) от общего числа наблюдений. Уровень СА-125 в сыворотке крови колебался от 52 до 7422 (медиана 832) МЕ/мл. Оценку числа интратуморальных лимфоцитов проводили в процессе ИГХ-исследования, на крио- статных срезах опухоли, отдельно в строме и паренхиме. Слабым или отрицательным (слабая степень лимфоцитарной инфильтрации) считался результат, при котором в поле зрения определялось менее 5 клеток, умеренным - 6-19 клеток, выраженным - более 20 клеток [11]. Проточная цитофлюориметрия была выполнена 11 больным. Образцы опухолевой ткани дезинтегрировали для получения суспензии клеток на аппарате Medimashin (BD, США). Дальнейшее исследование проводили на проточном цитометре FACScan (BD, США) с применением тройной флуоресцентной метки. Накапливали максимально возможное количество интратуморальных клеток ^D45+). В исследовании были использованы антитела «BD» (США): 1) CD45PE/Сy5/IgG1PE; 2) CD45PE/Cy5/CD3PE/IgG1FITC; 3) CD3PE/Cy5/СD8PE/CD4FITC; 4) CD3 PE/Cy5/СD25PE/CD4FITC. Математическая обработка данных осуществлялась с использованием программы SPSS. Результаты и обсуждение Умеренная и выраженная степени инфильтрации опухоли СD45-клетками встретилась в 59,2% наблюдений, CD7 клетками были инфильтрированы 37% опухолей, CD56 - 25% , CD8 - 30,7%, CD3 - 14,8%, CD4 - 11,5%, CD20 - 3,8%. В строме опухоли инфильтрация CD56 отмечена лишь в 8,6% наблюдений, CD3+ - в 33%, CD7+ - в 37%, что свидетельствует о различной инфильтрации паренхимы и стромы опухоли Т- и NK-клеточными популяциями. Преобладание зрелых Т-лимфоцитов (CD3 ) среди интратуморальных иммунокомпетент- ных клеток (CD45 ) подтверждено методом ПЦР (62-92,6%). В 4 случаях в ткани опухоли преобладали Т-киллеры (CD3CD8), составившие 62-75%, в стольких же наблюдениях процентное содержание CD3CD4- и CD3+cD8+-лимфоцитов было равным, в 3 случаях преобладали CD4 CD3 -лимфоциты. Выявлена взаимосвязь между инфильтрацией опухоли тумор-пенетрирующими лимфоцитами (ТПЛ) и степенью ее дифференцировки. В высокодифференцированных новообразованиях отмечена высокая концентрация CD7 и CD56 (см. таблицу). Кроме того, для высокодифференцированных аденокарцином была характерна низкая концентрация CD45+CD3+CD8+- и CD4+-лимфоцитов. В низкодифференцированных опухолях также выявлена высокая концентрация CD56+ и низкая концентрация CD4+. Остальные субтипы ТПЛ в низкодифференцированных карциномах выявлялись как в низкой, так и в высокой концентрациях в одинаковом количестве наблюдений. Для умеренно дифференцированных опухолей было характерно только высокое содержание CD56+. Таким образом, CD56+ при всех видах дифференцировки опухоли определялись в высоких концентрациях. Только один из исследуемых иммунологических показателей достоверно коррелировал со степенью дифференцировки опухоли - это концентрация CD3+. Так, строма высокодифференцированных образцов во всех случаях (100%) была слабо инфильтрирована CD3+. По мере снижения степени дифференци- ровки возрастала частота умеренной и выраженной инфильтрации стромы CD3+-клетками, составив соответственно 25 и 68,2% наблюдений (р = 0,01). Заключение Строма высокодифференцированной серозной аденокарциномы яичника во всех (100%) случаях была слабо инфильтрирована зрелыми Т-клетками (CD3+). По мере снижения степени дифференциров- ки опухоли возрастала частота умеренной и выраженной инфильтрации стромы зрелыми Т-клетками (CD3+), составив соответственно при умеренной н низкой степенях дифференцировки новообразования 25 и 68,2% наблюдений (р = 0,01). По нашему мнению, возрастание умеренной и выраженной инфильтрации CD3+-Т-клетками при снижении дифферен- цировки опухоли может быть связано с появлением на клетках новообразования опухолевых антигенов.

About the authors

Seda O. Nikoghosian

N.N. Blokchin Russian Cancer Research Center

Email: natalevicka@yahoo.com
MD, Phd, DSc 115478, Moscow, Russian Federation

N. N Tupitsyn

N.N. Blokchin Russian Cancer Research Center

115478, Moscow, Russian Federation

A. V Mozhenkova

N.N. Blokchin Russian Cancer Research Center

115478, Moscow, Russian Federation

N. V Kokosadze

N.N. Blokchin Russian Cancer Research Center

115478, Moscow, Russian Federation

N. V Levitskaya

Russian Medical Academy of Postgraduate Education

125993, Moscow, Russian Federation

E. V Zueva

N.N. Blokchin Russian Cancer Research Center

115478, Moscow, Russian Federation

V. V Kuznetsov

N.N. Blokchin Russian Cancer Research Center

115478, Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files