Multiparameter study of the immunophenotype of tumor infiltrating lymphocytes, in cancer patients

Full Text

Лимфоциты, инфильтрирующие опухоль (TIL), являются объектом возрастающего внимания исследователей во всем мире, однако понимание их роли в патогенезе рака до сих пор неизвестно. В то же время убедительно показано, что степень инфильтрации опухоли лимфоцитами определяет прогноз течения заболевания и выживаемость больных с различными нозологическими формами онкологических заболеваний [1-5]. Большинство этих исследований проведено с использованием иммуногистохимического КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ анализа фиксированных блоков, которое позволяет сопоставить лабораторные и клинические результаты. Однако данный методический подход дает информацию только о наличии инфильтрации и ее степени выраженности (низкая/высокая) [6]. Использование проточной цитометрии позволяет оценить субпопуляционную структуру лимфоцитов опухоли и достоверно определить направление генерации иммунного ответа на тканевом уровне, а также оценить фенотипическую гетерогенность популяционного состава иммунокомпетентных клеток. Сегодня высокотехнологичные иммунологические исследования являются крайне актуальными, поскольку в клиническую практику активно внедряются новые подходы лечения онкологических больных, в том числе с применением таргетной иммунотерапии. Все это указывает на актуальность данной работы. Цель - провести изучение иммунологической структуры лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, у онкологических больных. Материал и методы Образцы опухолевой ткани больных Исследовали образцы опухолевой ткани 104 больных с солидными опухолями, полученные интра- операционно или с помощью corr-биопсии. Образцы ткани помещали в 2 мл охлажденного раствора PBS, фрагментацию и анализ проводили в тот же день или хранили образцы при 4oC не более 12 ч. В исследование вошли пациентки с раком яичников (n = 11); меланомой (n = 37); раком слизистой оболочки полости рта (n = 9); раком молочной железы (n = 47). Получение суспензии клеток С целью получения клеточных суспензий фрагментацию ткани опухолей проводили с использованием системы Medimachine (BD Biosciences). Сначала опухоль гомогенизировали в нестерильных контейнерах (Medicons) для одноразового использования, затем фильтровали через фильтры Filcons с диаметром пор не более 50 мкм. Цитоморфологический анализ Все полученные образцы подвергались цито- морфологическому контролю в лаборатории клинической цитологии НИИ клинической онкологии с применением метода жидкостной цитологии. Для приготовления монослойных стандартных цитопрепаратов использовали систему Cytospin-3 в режиме 1000 оборотов в течение 5 мин. Препараты окрашивали по Лейшману, анализировали при увеличении в 200 и 400 раз. При цитоморфологическом анализе оценивали количество и качество опухолевых клеток, наличие лимфоидных элементов. Реакция иммунофлуоресценции Для многопараметрового анализа поверхностных антигенов использовали коммерческие моноклональные антитела (МКА) (Beckman Coulter, BD Biosciences), конъюгированные FITC, PE, PE-Cy5, APC к антигенам CD3, CD4, CD8, CD16, CD56, CD28, CD11b, CD25, CD127, HLA-Dr, CD19, CD45. Для оценки цитотоксического потенциала клеток- эффекторов применяли внутриклеточное окрашивание белка Perforin с помощью коммерческой тест- системы (BD Biosciences). Проточно-цитометрический анализ Структуру субпопуляций клеток оценивали по связыванию с МКА различной специфичности методом 4-цветного многопараметрового количественного анализа на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences). Накапливали 0,1-2 х 106 событий для каждого образца, анализировали не менее 500-5000 клеток в CD45+-гейте. Использовали DotPlot-анализ цитограмм с коммерческим программным обеспечением BD CellQuest PRO software (BD Biosciences). Дальнейшую обработку FSC-файлов первичных ци- тометрических данных проводили с использованием программного пакета WinMDI, версия 2.8. Статистическая обработка результатов Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного обеспечения Sigma Plot 11.0 for Windows. Достоверность различий в исследовании оценивали по t-критерию Стьюдента и непараметрическим критериям Вилкоксона-Манна- Уитни и Фишера в зависимости от характера распределения значений выборки. Различия считали достоверными при р < 0,05. Все результаты представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки. Результаты На первом этапе работы было проведено исследование количества лимфоидных клеток в полученных суспензиях, отражающих степень инфильтрации лимфоцитами опухолевой ткани различных локализаций. С этой целью образцы анализировали методом проточной цитометрии с учетом малоуглового светорассеяния SSC в сочетании с окрашиванием МКА анти-CD45, а также с помощью цитоморфо- логического метода жидкостной цитологии. Иммунологический анализ цитограмм SSC против CD45 образцов опухолевых клеток методом проточной цитометрии показал, что лимфоидные клетки (TIL) c фенотипом CD45+ выявлялись в 100% случаев и это не зависело от объема опухолевой ткани и способа ее получения (интраоперационно или путем corr-биопсии). Однако содержание TIL c фенотипом CD45+ в полученных суспензиях значительно варьировало от 0,4 до 35%, среднее значение составило 4,9±1,3%. В то же время при цитоморфологическом исследовании в ряде случаев лимфоидные элементы не обнаружены. Так, по данным иммунологического анализа, у больных И. и Н. с диагнозом рака молочной железы было выявлено 2,1 и 11,8% соответственно CD45+-лимфоцитов, в то время как при морфологическом исследовании образцы оказались отрицательными. Аналогичным образом у 2 больных злокачественной меланомой количество CD45- лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, составило 0,1 и 0,2%, а по данным морфологии, образцы были негативными (рис. 1 и 2, см. вклейку). Исследование субпопуляционной структуры CD45+-лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, проводили с помощью метода многопараметровой проточной цитометрии. Прежде всего оценивали количество линейных (Т-В-NK) популяций лимфоцитов. Было обнаружено, что в структуре TIL значительно преобладают CD45CD3+CD19- Т-клетки, их уровень составил 91±1,3%, количество NK-клеток с фенотипом CD45+CD3"CD16+CD56+ среди лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, составило 3,7±0,2%, а CD45+CD3-CD19+ В-лимфоцитов - 2±0,6%. Соотношение CD4/CD8-клеток, характеризующее суб- популяционную структуру CD3-лимфоцитов, оказалось практически равным 1,1±0,1, при этом популяция CD8-лимфоцитов на 96,4% была представлена CD45+CD3+CD8+-специфическими цитотоксически- ми лимфоцитами (ЦТЛ), а уровень неспецифических CD8-эффекторных клеток с фенотипом CD45+CD3- CD8+ составил 1,6±0,4%. Количество клеток с экспрессией антигенов поздней и ранней активации HLA-Dr+ и CD25+ составил 2,8±0,9 и 14,4±2,6% соответственно. Не было выявлено активированных CD3+HLA-Dr+ Т-клеток, однако обнаружены активированные CD4-лимфоциты с коэкспрессией CD25+ (11,0±2,1%). Исследование цитотоксического потенциала NK- клеток и Т-клеток, оцениваемого по содержанию внутриклеточного перфорина, показало, что в структуре TIL только 46,8±7,5% NK-клеток являются функционально активными и имеют фенотип CD45+CD3"CD16+Perforin+. Среди CD8-клеток- эффекторов перфорин-позитивные клетки составили лишь 3,3±0,8%. Для анализа CD4- и CD8-клеток, осуществляющих негативную регуляцию иммунных реакций, был использован прием последовательного гейти- рования. Уровень регуляторных клеток с фенотипом CD45+CD4+CD127+low/neg составил 10,4±2,2% среди CD4 Т-лимфоцитов, однако в структуре CD8 количество регуляторных клеток с фенотипом CD45+CD8+CD28-CD 11b' составило 54,5±6,9%. Особо следует отметить, что субпопуляционная структура лимфоцитов в исследуемых опухолях различных локализаций оказалась аналогичной, что позволило нам проводить анализ всей группы пациентов. Полученные результаты анализа иммунофенотипа TIL представлены в таблице. Обсуждение В данной работе впервые в России проведено многопараметровое исследование иммунофенотипа TIL с помощью количественного метода проточной цитометрии. В отличие от иммуногистохимического анализа, который широко используется за рубежом, данный методический подход позволяет идентифицировать единичные события по определенному критерию. Так, в качестве маркера для выделения «гейта» лимфоцитов были использованы МКА к общелейкоцитарному антигену CD45 с одновременным учетом гранулярности клеток. В нашем исследовании во всех анализируемых образцах опухолевой ткани были обнаружены CD45+-лимфоциты, однако их количество сильно варьировало. В некоторых случаях при низком содержании CD45+-клеток анализу подвергалось до 2 х 106 клеток, при этом параллельное цитоморфологическое исследование фиксировало отрицательный результат. Следует заметить, что степень инфильтрации опухоли лимфоцитами сегодня рассматривается как благоприятный прогностический фактор эффективного ответа на проводимое лечение и общую выживаемость больных раком молочной железы, раком яичников, колоректальным раком, раком слизистой оболочки полости рта, раком мочевого пузыря, меланомой и другими нозологиче- CLINICAL INVESTIGATIONS Иммунофенотип TIL (M ± т) Показатель Значение, % CD45+ 4,9 ± 1,3 CD3+ 91,0 ± 1,3 CD3+CD4+ 47,1 ± 2,2 CD3+CD8+ 43,5 ± 2,7 CD3-CD8+ 1,6 ± 0,4 CD8+ 45,1 ± 2,8 CD3+HLA-DR+ 1,8 ± 0,3 HLA-DR 2,8 ± 0,9 CD3-CD16+CD56+ 3,7 ± 0,2 CD3+CD16+CD56+ 3,2 ± 0,9 CD3-CD19+ 2,0 ± 0,6 CD4+CD25+ 11,0 ± 2,1 CD25+ 14,4 ± 2,6 CD8+CD16+ 4,5 ± 0,9 CD16+Perforin+ 5,2 ± 1,4 active CD16 46,8 ± 7,5 CD8+Perforin+ 3,3 ± 0,8 active CD8 8,7 ± 2,0 CD4/CD8 1,1 ± 0,1 CD4+CD127+CD25+ 10,4 ± 2,2 CD8+11b+CD28- 8,9 ± 2,1 CD8+CD11b+CD28+ 14,9 ± 4,5 CD8+CD11b-CD28- 54,5 ± 6,9 CD8+CD11b-CD28+ 16,7 ± 4,8 скими формами опухолевых заболеваний [7, 8]. Также одним из преимуществ используемого в исследовании методического подхода является возможность одновременного анализа коэкспрессии нескольких антигенов на/в единственной лимфоидной клетке в пределах многокомпонентной клеточной системы, что позволило нам идентифицировать различные линейные популяции и их субпопуляции, включая минорные, и выявить некоторые закономерности. Так, в линейной структуре лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, преобладают Т-клетки, их количество составляет почти 90%, следовательно, на долю В- и NK-клеток приходится около 10%. Аналогичные результаты по структурной организации лимфоцитов опухолевой ткани были получены А. Rathore и соавт. [9], но с использованием иммуно- гистохимического исследования. Проведенный анализ соотношения субпопуляций Т-клеток CD4/CD8 оказался практически равным и составил 1,1±0,1, что свидетельствует о равнозначности функционирования данных клеточных популяций в опухолевой ткани. О позитивной роли инфильтрации опухоли CD3-, CD4-, CD8-лимфоцитами указывают в своих работах S. Han и соавт., P. Cermakova и соавт. [10, 11] . Однако данные результаты получены при имму- ногистохимическом исследовании, возможности которого не позволяют проводить анализ фенотипической гетерогенности субпопуляционной структуры CD4- и CD8-лимфоидных клеток. КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Нами замечено, что в опухолевой ткани среди CD3-клеток отсутствуют активированные CD3+HLADr+ Т-лимфоциты, однако, как видно из таблицы, антиген ранней активации CD25 в основном представлен на поверхности CD4-клеток с одновременной коэкспрессией антигена CD127. Данный фенотип характерен для популяции CD4 Т-регуляторных клеток, однако их количество составило лишь 10,4±2,2%, что, по нашему мнению, не может оказывать существенного влияния на иммунный ответ. В то же время, согласно данным литературы, популяция CD4 Т - лимфоцитов коррелирует с неблагоприятным прогнозом при злокачественных опухолях различных локализаций [12, 13]. Значимые результаты получены при анализе фенотипической структуры CD8-лимфоцитов, в состав которых входят активированные, наивные, цитоток- сические и регуляторные клетки, оцениваемые по сочетанию коэкспрессии антигенов CD11b и CD28. Оказалось, что среди популяции CD8-клеток преобладают лимфоциты с фенотипом CD8+CD11b- CD28-, который соответствуют CD8 Т-лимфоцитам с негативной регуляцией иммунного ответа и составляют 54,5±6,9%. При анализе источников литературы не обнаружены подобные результаты, вероятно, обусловлено это именно ограниченными методическими возможностями иммуногистохимических исследований. В то же время отмечается прогностическое значение инфильтрации опухоли CD8- клетками независимо от гистологического варианта, локализации в строме или опухолевой ткани, пола, возраста пациентов [14, 15]. Таким образом, исследование фенотипа TIL выявило структурные особенности распределения субпопуляций лимфоидных клеток и позволяет заключить, что в генерации иммунных реакций на тканевом уровне у больных солидными новообразованиями преобладают регуляторные механизмы иммунологического ответа с участием CD8 Т-клеток. Выводы 1. С помощью метода проточной цитометрии TIL выявляются в 100% случаев. 2. Иммунофенотип TIL опухолей различных локализаций имеет сходный характер. 3. В линейной структуре TIL преобладают CD3+ Т-лимфоциты (91±1,3%). 4. В структуре CD3+ Т-лимфоцитов соотношение CD4/CD8 составляет 1,1±0,1. 5. Эффекторное звено TIL представлено специфическими цитотоксическими CD3+CD8+ ЦТЛ (96,4%). 6. Уровень регуляторных Т-лимфоцитов CD45+CD4+ CD127+low/neg и CD45+CD8+CD28-CD11b- составил 10,4±2,2 и 54,5±6,9% соответственно 7. Независимо от нозологической формы заболевания в генерации иммунных реакций на тканевом уровне у больных солидными новообразованиями преобладают регуляторные механизмы иммунологического ответа. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

About the authors

Tat’yana N. Zabotina

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Email: tatzabotina@yandex.ru
MD, Phd, DSc, leading researcher of the Laboratory of Clinical immunology of tumors of the Research Institute of Clinical Oncology Moscow, 115478, Russian Federation

O. V Korotkova

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

A. A Borunova

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

D. V Tabakov

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

I. I Bokin

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

I. V Panichenko

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

M. V Savostikova

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

I. V Samoylenko

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

V. T Tsiklauri

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

Sh. G Khakimova

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

Z. G Kadagidze

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

References

Supplementary files