THE ROLE OF GENES RAD50 AND SMARCA5 IN REGULATION OF SENSITIVITY TO CISPLATIN IN TUMOR CELLS OF OVARIAN, HEAD AND NECK CANCER

Full Text

Несмотря на прогрессивное развитие таргетных противоопухолевых препаратов, воздействующих на специфические для опухолевых клеток молекулярные мишени, применение классических химиопрепаратов с высоким цитотоксическим действием продолжает занимать значительное место в монотерапии и комбинированной терапии рака. Цисплатин, несмотря на выраженное побочное действие, остается стандартом терапии для ряда опухолей, таких как рак яичника, яичка, молочной железы (РМЖ), легкого, головы и шеи, желудка, толстой кишки, почки, мочевого пузыря и других видов рака. Цисплатин вызывает нарушения молекулярной структуры ДНК, которые заключаются в формировании моноаддуктов и поперечных сшивок, индуцирующих образование двухцепочечных разрывов ДНК и активацию сигнальных путей апоптоза в опухолевых клетках [1, 2]. Следует отметить, что эффект цисплатина варьирует у разных больных, что предположительно связано с различным ответом на применяемую терапию вследствие индивидуального разнообразия молекулярных нарушений в опухолях пациентов. Прогноз течения заболевания нередко определяется степенью чувствительности опухоли к терапии цисплатином. Устойчивые к действию цисплатина опухоли имеют крайне неблагоприятный прогноз. Молекулярные механизмы устойчивости к цисплатину не до конца изучены, однако известно, что в них участвуют сигнальные пути, активирующиеся в ответ на повреждение ДНК (DDR - DNA Damage Response) [3-5]. Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе действия цисплатина, а также поиск новых маркеров, вовлеченных в регуляцию ответа на терапию цисплатином, могут не только значительно улучшить эффект этого препарата, но также позволят предсказывать, будет ли лечение эффективным у того или иного больного. Для поиска потенциальных опухолевых маркеров нами был использован метод SEREX (Serological Identification of cDNA Expression Libraries), который выявил два аутоантигена медуллярной карциномы молочной железы, а именно RAD50 и SMARCA5, которые могут быть вовлечены в регуляцию чувствительности злокачественных опухолей к терапии ДНК повреждающими агентами и являются потенциальными предиктивными маркерами терапии цисплатином [6-8]. RAD50 входит в состав комплекса MRN (Mre11/RAD50/Nbs1), осуществляющего репарацию двухцепочечных разрывов ДНК и поддержание целостности теломер [9, 10]. Было показано, что подавление экспрессии RAD50 влияет на чувствительность клеток рака молочной железы к повреждающему действию цисплатина [11, 12]. Белок SMARCA5/SNF2H входит в состав различных ремоделирующих хроматин комплексов, а также вовлечен в ответ на повреждения ДНК. Было показано, что подавление экспрессии SMARCA5 увеличивает чувствительность опухолевых клеток к действию ионизирующей радиации, которое заключается в формировании двухцепочечных разрывов ДНК [13]. Эти данные могут свидетельствовать о потенциальной вовлеченности SMARCA5 в регуляцию ответа на терапию цисплатином, который имеет сходный механизм с действием ионизирующей радиации. Молекулярные механизмы, ответственные за привлечение RAD50 и SMARCA5 к месту повреждения ДНК, схематично представлены на рис. 1. Целью данной работы являлась оценка влияния генов RAD50 и SMARCA5 на чувствительность к цисплатину и их роли в регуляции ответа на повреждение ДНК в клеточных линиях рака яичника (OVCAR8) и головы и шеи (SCC61, SCC25). Для оценки специфичности данного влияния мы также изучали действие нокдауна данных генов на чувствительность к ряду других химиопрепаратов, таких как 5-фторурацил (5-ФУ) и олапариб, имеющих отличный от цисплатина молекулярный механизм повреждения ДНК. 5-ФУ приводит к угнетению репликации ДНК путем истощения запаса тимина в клетке, а олапариб вызывает повреждение ДНК путем ингибирования поли-(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP1), участвующей в репарации ДНК. Материал и методы Культура клеток В экспериментах in vitro были использованы клеточные линии плоскоклеточной карциномы головы и шеи SCC61 и SCC25 (American Type Culture Collection (ATCC), США), а также клеточная линия карциномы яичника OVCAR8, резистентная к действию цисплатина. Клетки SCC61 и SCC25 культивировали в бреде DMEM-F12, содержащей 10% сыворотки теленка и 1% L-глютамин, пенициллин и стрептомицин («Sigma», США). Клетки OVCAR8 культивировали в среде RPMI-1640, также содержащей 10% сыворотки теленка и 1% L-глютамин, пенициллин и стрептомицин. Трансфекция клеток при помощи миРНК, обработка клеток лекарственными препаратами, анализ выживаемости клеток Все миРНК были приобретены в фирме «Qiagen» (Германия). Трансфекцию клеток проводили в 96-луночном планшете при помощи 10 нМ миРНК и трансфекционного реагента DF1 («Dharmacon», США) согласно протоколу производителя. Количество клеток, вносимых в каждую лунку 96-луночного планшета, различалось между клеточными линиями: 10 000 клеток на лунку для SCC61 и SCC25, 4000 клеток на лунку для OVCAR8 в финальном объеме питательной среды 90 мкл на лунку. Через 24 ч после трансфекции к клеткам добавляли лекарственные вещества, применяемые в лечении опухолей головы и шеи, а также рака яичника: цисплатин, (5-ФУ) и олапариб (Fox Chase Cancer Center, Cell Culture Facility, США). Через 72 ч после добавления лекарств проводили анализ выживаемости клеток. К клеткам добавляли 10 мкл на лунку реагента Cell Titer Blue («Promega», США). Через 3 ч после добавления реагента флюоресценцию клеток считывали при помощи спектрофотометра на длине волны 573 нм. Интенсивность сигнала была прямо пропорциональна количеству жизнеспособных клеток в лунке. Ген REV3L, известный как регулятор чувствительности к цисплатину согласно данным литературы и связанный с DDR, был взят в качестве положительного контроля сенситизации к цисплатину [14-16]. В качестве отрицательного контроля использовали РНК против гена GL2, кодирующего люциферазу светлячка, не имеющую мишени в клетках человека. Результаты анализа были нормализованы на контроль GL2. Анализ фосфорилирования гистонового белка H2AX методом иммунофлуоресцентной микроскопии Количественная оценка фокусов репарации ДНК, возникающих в результате фосфорилирования гистонового белка H2AX (γ-H2AX - обозначение для фосфорилированной формы белка), который является маркером двухцепочечных разрывов ДНК, выполнена при помощи автоматизированного высокопроизводительного флуоресцентного микроскопа ImageXpress Micro с использованием программного обеспечения MetaXpress и AcuityXpress («Molecular Devices», Саннивейл, США). Предварительно была проведена трансфекция клеток OVCAR8, SCC61 и SCC25 в 96-луночном планшете. миРНК против гена CHEK1 использовали в качестве положительного контроля, поскольку, согласно данным литературы, нокдаун этого гена сам по себе повышает базовый уровень фокусов репарации ДНК, образованных γ-H2AX [17, 18]. миРНК против гена GL2 использовали в качестве отрицательного контроля. Через 24 ч после трансфекции к клеткам было добавлено 16 и 30 uM цисплатина или питательная среда в том же объеме в качестве контроля. Через 18 ч клетки отмыли холодным натрий-фосфатным буфером и зафиксировали 4% параформальдегидом, в течение 10 мин клетки были вновь отмыты и пермеабилизованы 0,1% раствором Triton-X100 («Sigma-Aldrich» США). Окрашивание клеток проводили с использованием первичных антител к γ-H2AX (1:1000, Mouse Monoclonal, Millipore Upstate, Биллерика, США) в течение 12 ч при 4 °C и вторичных антител, меченных FITC (1:1000, goat anti-mouse IgG (H+L), «AlexaFluor»® 488 conjugate), в течение 1 ч при комнатной температуре. Результаты Влияние нокдауна генов RAD50 и SMARCA5 на выживаемость и чувствительность к цисплатину и другим химиопрепаратам в клеточных линиях рака яичника OVCAR8 и плоскоклеточной карциномы головы и шеи SCC61 и SCC25 Нами были установлены влияние, которое оказывает нокдаун RAD50 и SMARCA5 на жизнеспособность опухолевых клеток человека, и роль данных генов в регуляции чувствительности опухолевых клеток к цисплатину, а также другим распространенным в терапии рака яичника и опухолей головы и шеи химиопрепаратам, таким как 5-ФУ и олапариб. Для нокдауна каждого гена использовали смесь двух лучших миРНК, заявленных фирмой-производителем («Qiagen», Германия). Через 24 ч после трансфекции к клеткам добавляли цисплатин в концентрации IC20-IC30 (рис. 2) и питательную среду в таком же объеме, что и цисплатин, в качестве отрицательного контроля. Нокдаун генов RAD50 и SMARCA5 значительно снижал жизнеспособность (на 30-60%) опухолевых клеток (рис. 3). При этом наиболее выраженный цитотоксический эффект нокдауна данных генов был показан в клеточной линии рака яичника OVCAR-8, резистентной к действию цисплатина (см. рис. 3, в). Таким образом, можно предположить, что экспрессия этих генов играет существенную роль в жизнедеятельности опухолевых клеток. Мы оценивали влияние нокдауна генов RAD50 и SMARCA5 на чувствительность клеток непосредственно к цисплатину. После 72 ч обработки препаратом мы обнаружили повышение чувствительности к токсическому действию цисплатина в клеточных линиях опухоли головы и шеи с нокдауном генов RAD50 и SMARCA5 (для нокдауна данного гена эффект сенситизации наблюдался по крайней мере в одной из клеточных линий) (см. рис. 2, а, б). Эти результаты коррелируют с данными, полученными на клеточных линиях рака молочной железы для гена RAD50 [11]. В клеточной линии OVCAR-8, полученной от пациентки с приобретенной устойчивостью к терапии цисплатином, также наблюдался выраженный эффект сенситизации к цисплатину в случае нокдауна генов RAD50 и SMARCA5 (см. рис. 2, в). Эти данные могут свидетельствовать о том, что гены RAD50 и SMARCA5 могут быть вовлечены в механизм резистентности клеточной линии OVCAR8 к действию цисплатина. Мы также определяли, насколько специфичен к действию цисплатина оказываемый эффект сенситизации, повторив эксперимент с участием других препаратов, повреждающих ДНК. Паттерны сенситизации к 5-ФУ и олапарибу были сходны с паттерном чувствительности к цисплатину (см. рис. 2). Можно предположить, что данный эффект связан со сходными молекулярными механизмами, определяющими чувствительность опухолевых клеток к данным ДНК-повреждающим препаратам. Так, распознавание повреждений ДНК и активация систем ответа на повреждение - базовый неспеци-фический процесс, не зависящий от рода повреждающего агента (ионизирующая радиация или химиотерапевтический препарат). Повреждение ДНК связано с фосфорилированием главных киназ ATR и ATM, отвечающим за активацию множества сигнальных путей, ответственных за различные виды репарации и регуляцию клеточного цикла в клетке. Под действием киназ ATR/ATM с последующей активацией киназ CHEK1 и CHEK2 [19] в области повреждения ДНК фосфорилируется гистоновый белок H2AX, что является первым этапом в запуске сигнального каскада, вызывающего привлечение в место повреждения белков и сборку комплексов репарации. Нарушение ответа на повреждение ДНК на самых ранних этапах может лежать в основе сенситизации опухолевых клеток с нокдауном генов RAD50 и SMARCA5 к действию ДНК повреждающих препаратов. Влияние нокдауна генов RAD50 и SMARCA5 на фосфорилирование гистонового белка H2AX, известного маркера повреждения ДНК в клеточной линии рака яичника OVCAR-8 и плоскоклеточной карциномы головы и шеи SCC61 и SCC25 Для проверки данной гипотезы о возможном молекулярном механизме, лежащем в основе сенситизации опухолевых клеток с нокдауном генов RAD50 и SMARCA5 к ДНК-повреждающим препаратам, мы исследовали влияние нокдауна данных генов на формирование фокусов репарации - H2AX. Хорошо известно, что повреждение ДНК, в том числе вызванное действием цисплатина, характеризуется формированием фокусов репарации, которые возникают в результате фосфорилирования гистонового белка H2AX (γ-H2AX) [20, 21]. Было показано, что нокдаун гена SMARCA5 не оказывал влияния на уровень γ-H2AX в присутствии цисплатина, однако приводил к увеличению базового уровня фокусов γ-H2AX в контрольных образцах без добавления цисплатина. В то же время нокдаун гена RAD50 не менял ни базовый γ-H2AX, ни уровень фосфорилирования гистонового белка в присутствии цисплатина (рис. 4). Данные результаты указывают на роль SMARCA5 в регуляции уровня фосфорилирования гистонового белка H2AX. Отсутствие влияния нокдауна генов на уровень фосфорилирования H2AX в условиях повреждения ДНК позволяет предположить, что влияние данных генов на чувствительность к цисплатину связано с более поздними этапами активации ответа клетки на повреждение. Таким образом, идентификация молекулярных механизмов регуляции данными генами чувствительности к цисплатину требует дальнейших исследований. Обсуждение RAD50 и SMARCA5 играют важную роль в процессах репарации ДНК и являются известными маркерами резистентности к цисплатину при раке молочной железы [9-12, 22, 23]. В данной работе нами была показана роль генов RAD50 и SMARCA5 в регуляции жизнеспособности клеток опухолей головы и шеи и рака яичника. Кроме того, мы продемонстрировали роль данных генов в регуляции чувствительности опухолевых клеток к цисплатину и другим химиотерапевтическим ДНК-повреждающим препаратам, применяемым в лечении опухолей головы и шеи и рака яичника. Нокдаун генов RAD50 и SMARCA5 значительно увеличивал чувствительность клеток данных опухолей к цисплатину, 5-ФУ и олапарибу. Нами установлена роль гена SMARCA5 в регуляции базового уровня фосфорилирования H2AX. Однако нокдаун обоих генов не влиял на уровень γ-H2AX в присутствии цисплатина. Очевидно, молекулярные механизмы сенситизации к ДНК-повреждающим препаратам в данном случае реализуются на более поздних этапах ответа на повреждение. Следует отметить, что повреждающее действие цисплатина, 5-ФУ и олапариба связано также с активацией эксцизионной репарации (nucleotide excision repair (NER)) и репарацией путем гомологичной рекомбинации (homologous recombination (HR)), а также блокадой клеточного цикла на этапе репликации ДНК (блокада G1-S и S-фазы клеточного цикла) [24-27]. Оценка роли этих процессов в сенситизации к ДНК-повреждающим препаратам, опосредованной нокдауном RAD50 и SMARCA5, требует дальнейших исследований. Таким образом, гены RAD50 и SMARCA5 являются потенциальными терапевтическими мишенями в лечении и предиктивными маркерами ответа на терапию цисплатином и другими ДНК-повреждающими препаратами у пациентов с плоскоклеточной карциномой головы и шеи и раком яичника. Мы надеемся, что полученные нами данные помогут лучше понять механизмы возникновения резистентности и разработать возможные пути ее преодоления в клинике.

About the authors

A. V Gaponova

Kazan Federal University

Email: annagaponova28@gmail.com
Kazan, 420008, Russian Federation

I. G Serebriiskii

Kazan Federal University

Kazan, 420008, Russian Federation

R. G Kiyamova

Kazan Federal University

Kazan, 420008, Russian Federation

References

Supplementary files