C. difficile toxins A and B from the clinician's viewpoint

Full Text

С тех пор как E. Roux и A. Yersin в 1888 г. впервые выделили от больного дифтерийный токсин и продемонстрировали его токсические свойства на экспериментальной модели, бактериальные токсины (БТ) были признаны ведущими факторами патогенности, играющими исключительную роль в патогенезе многих бактериальных инфекций [1-5]. БТ оказались тонким молекулярным инструментом, вмешивающимся во внутриклеточные процессы, изменяя дифференцировку, пролиферацию, рост, метаболизм чувствительных клеток и как следствие, нарушая их интегративные связи, эффекторные функции вплоть до гибели посредством индукции апоптоза. Столь активное участие в развитии инфекционного процесса на клеточном уровне не может не оказывать системного действия на организм [1, 6]. Так, установлено, что различные бактерии способны вырабатывать сходные токсины, что в клинике инфекционных болезней проявляется сходством клинических проявлений различных по этиологии заболеваний. Группа острых кишечных инфекций (ОКИ) является одной из наиболее полиэтиологич-ных, их клинические проявления в основном сведены в несколько синдромов, например интоксикации, диарейный и др. Нередко энтеропатогенные бактерии вырабатывают не один, а несколько токсинов, что также может оказывать влияние на клиническую манифестацию заболевания. Бактерии вырабатывают сотни различных белковых токсинов, которые могут быть разделены в зависимости от характера взаимодействия с клетками и вызываемого эффекта на 5 групп: 1) повреждающие клеточные мембраны; 2) ингибиторы синтеза белка; 3) активирующие пути метаболизма, контролируемые посредниками (мессенджерами); 4) протеазы; 5) суперантигены, активирующие иммунный ответ макроорганизма. К 3-й группе относятся токсины А и В C. difficile (TcdA, TcdB, C. dif.) [5]. Впервые C. dif. были описаны в середине 1930-х годов I. Hall и E. O’Toole, но только в 1978 г. они были идентифицированы как этиологический фактор тяжелого поражения кишечника, обозначаемого как псевдомембранозный колит (ПМК), а позже и как возбудитель антибиотико-ассоцированной диареи (ААД) [3, 7, 8]. На сегодняшний день C. dif. рассматривается как ведущая причина внутрибольничных диарей, распространенных преимущественно в экономически развитых странах [7]. Проспективное исследование на основании анализа 2462 историй болезней 5 стационаров Швеции показало, что частота развития ААД составляет 4,9% [9]. В США, по расчетным данным, ежегодно возникает свыше 250 000 случаев C. dif. -АДД, экономический ущерб от которых ежегодно составляет около 1 млрд долл. США [10, 11]. Для корреспонденции: Гюлазян Наира Мартуновна, доктор мед. наук, проф. каф. инфекционных болезней ЕГМУ им. М. Гераци, Ереван, Армения, e-mail: g.naira@rambler.ru Широкому распространению C. dif. и возрастанию их удельного веса в структуре ОКи способствуют несколько факторов, среди которых особое место занимают: а) высокая устойчивость к факторам внешней среды и дезинфицирующим средствам спор C. dif., в результате чего инфицирование людей происходит даже при кратковременном пребывании в стационаре; б) широкое применение в клинической практике антимикробных, химиотерапевтических и других препаратов, нарушающих микробиоценоз кишечника и способствующих развитию инфекции; в) несовершенство или неадекватное использование методов диагностики. Сложность лабораторно-экспериментального исследования инфекции C. dif. заключается в том, что микроб не поддается генетическим манипуляциям и до сих пор не получены изогенные штаммы, дефицитные по токсинообразованию. Только относительно недавно от больных были изолированы штаммы, способные вырабатывать только один токсин [12, 13]. На сегодняшний день выделяют по крайней мере 14 серогрупп C. dif., но это имеет лишь относительное клиническое значение, поскольку токсиноо-бразование не зависит от серогруппы. В результате обмена генетической информацией между C. dif. различные штаммы могут различаться между собой и классифицироваться по токсинотипам, которых выделяют свыше 20 [8]. Гены, кодирующие синтез токсинов TcdA и TcdB C. dif. (tcdA и tcdB), локализованы в локусе патогенности 19,6 kb (PaLoc), включающем еще 3 гена -tcdD, tcdE и tcdC, роль которых до сих пор остается неясной. Нетоксигенные штаммы не имеют данного локуса, не способны вырабатывать токсин и вызывать заболевание у людей [14]. Исследования структуры генома Gdif. свидетельствуют также о наличии гена txeR, который расположен выше группы генов, кодирующих синтез токсинов. Как показали исследования, белок TxeR, кодируемый txeR-геном, необходим для экспрессии tox-генов in vivo и активизации транскрипции tox-генов in vitro вместе с РНК-полимеразами C. dif., B. subtilis или E. coli [15]. Экспрессия продукции TcdA и TcdB происходит в log-фазе и стационарной фазе роста вегетирующих форм в ответ на различные сигналы окружающей среды. Точный характер сигналов окружающей среды, модулирующих экспрессию токсина, остается неясным. В исследованиях in vitro установлено, что экспрессия токсина может быть увеличена стрессом (в том числе в результате воздействия антибиотиков) и подавлением катаболизма. Исходя из значения антибиотиков в развитии ПМК, внимание исследователей было сфокусировано на потенциальном влиянии различных антибиотиков на токсинообра-зование. Субингибирующие уровни пенициллина и ванкомицина увеличивали токсинообразование в перевиваемых культурах C. dif. [16], однако после проведения дополнительных исследований мысль о 43 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 6, 2013 том, что антибиотики могут быть специфическими индукторами экспрессии токсина, поддержана не была. Однако теоретически до сих пор допускается мысль, что антибиотики могут индуцировать экспрессию токсинов C. dif. посредством стрессового воздействия. TcdA и TcdB, вырабатываемые C. dif., входят в семейство так называемых больших клостридиальных токсинов, в которое входят также летальный и геморрагический токсины C. sordellii [8, 17] и α-токсин C. novyi, основной мишенью которых являются внутриклеточные белки проводящих сигнальных путей клетки. Данные вещества представляют собой единую полипептидную цепь массой 250-308 кД. На N-концевом участке локализован ферментативный домен, опосредующий модификацию эукариотических белков-мишеней путем присоединения к ним остатков гексозы [8]. Выделяемые из клинических образцов штаммы С. dif. могут различаться по количеству синтезируемых токсинов и их биологической активности. Как показывают многочисленные исследования, большинство штаммов, выделенных от больных, вырабатывают оба токсина, но описаны наблюдения, когда изолировались не продуцирующие токсины штаммы или вырабатывающие только один из токсинов [13]. Как и для любых белковых бактериальных экзотоксинов, ключевым этапом в реализации клеточных эффектов является взаимодействие и связывание токсина с рецепторами на клетках-мишенях. Рецептором для TcdA, как показывают исследования, является дисахарид Galß1-4GlcNac. Данный дисахарид обнаружен в антигенах крови I, X, и Y и присутствует на различных типах клеток [18]. Различные виды животных восприимчивы к действию токсина А, но у них необязательно обнаруживаются абсолютно идентичные рецепторы. Так, например, известно, что у некоторых животных TcdA связывается с Gala1-3Galß1-4GlcNAc [19], но данный рецептор не обнаруживается в клетках человека. Важность данного дисахарида в связывании TcdA подтверждается наблюдениями, что обработка клеток или тканей галактозидазой снижает связывание токсина [19, 20]. На эпителиальных клетках кишечника кроликов был описан еще один рецептор TcdA, представляющий собой по химической структуре сукрозу-изомальтозу, но данной структуры также не было обнаружено в кишечнике людей. Еще более сложным остается вопрос идентификации рецепторов для TcdB. Как показывают многочисленные исследования, он демонстрирует широкие возможности взаимодействия с различными типами клеток, в силу чего делается заключение об убиквитарном распространении рецепторов, хотя сами они пока остаются неидентифицированными. Процесс транслокации токсинов, как показывают исследования, является не менее важным этапом в реализации биологической активности токсинов, чем процесс их связывания с рецепторами. Поскольку поступление токсинов в клетку происходит рецептор-опосредованным эндоцитозом, их цито-токсические эффекты могут быть полностью ингибированы при использовании различных лизосомо-тропных ингибиторов, как, например, бафиломи-цин А или хлористый аммоний [21]. Позднее было установлено, что предотвращение слияния эндосом с лизосомами также способно снижать активность TcdB [22]. Требование транслокации токсинов в эн-досомах с низким pH, как оказалось, также исключительно важно для реализации их биологической активности, поскольку кислая среда способствует необходимым структурным изменениям и именно посредством pH-зависимого механизма происходит формирование TcdB-каналов в липидном бислое. Длительное время было неясно, целая молекула токсина или только его каталитический домен трансло-цируется в цитоплазме. И только относительно недавно [23] было установлено, что в результате проте-олитического расщепления только N-терминальная область каталитического домена TcdB выходит из эндосомы и получает доступ к субстрату. Классическим признаком воздействия TcdA и TcdB на клетки-мишени является изменение организации актина цитоскелета [24, 25], что, как полагают, предшествует гибели клетки. Будучи гликозилтрансфера-зами, как TcdA, так и TcdB инактивируют маленькие GTPазы, к числу которых относятся белки Rho (изоформы Rho A, B и C убиквитарно обнаруживаются в эукариотических клетках млекопитающих), Rac и Cdc42, которые являются первичными регуляторами актина цитоскелета [26, 27]. Инактивация маленьких GTPаз приводит к конденсации актина, последующему округлению клетки, вспениванию мембраны, апоптозу и гибели клетки-мишени. Оба токсина проявляют свою активность на широком диапазоне типов клеток. TcdB демонстрирует более высокую энзиматическую активность, чем TcdA (на различных типах клеток они могут различаться в 4—200 раз!) [11]. Округление клетки наблюдается менее чем через 2 ч после начала экспозиции TcdB, тогда как гибель клетки не наступала ранее чем через 24 ч [28]. Выраженный временн0й интервал от первых проявлений действия токсина на клетку до индукции ее апоптоза свидетельствует о более сложном механизме действия токсинов на клетки-мишени. В связи с этим допускается, что токсины могут вызывать физиологические ответные реакции клетки, непосредственно не связанные с регуляцией актина цитоскелета, например стимулировать продукцию цитокинов. В частности, известно, что TcdA и TcdB вовлечены в клеточный хемотаксический ответ при инфекции С. dif. [29], однако это представляется несколько парадоксальным, поскольку необходимые для этого процесса первичные клеточные факторы Rho, Rac и Cdc42 инактивируются. TcdB способен изменять активность фосфолипазы A2 в токсино-бработанных клетках, причем этот процесс также 44 модулируется независимо от событий, связанных с изменением в цитоскелете клетки [30]. TcdA способен дифференцированно активировать экспрессию хемокинов эпителиальными клетками кишечника у человека и повышать проницаемость монослоя эпителиальных клеток кишечника [31], что может служить дополнительными механизмами, увеличивающими выраженность воспалительной реакции в кишечнике. TcdA стимулирует выработку цитокинов, которые занимают важное место в развитии ПМК [32]. Показано, что он индуцирует секрецию ИЛ-8 и кислородных радикалов колоноцитами человека [33], а также способен активировать протеинкиназы в моноцитах человека с продукцией ИЛ-8, причем данный механизм также независим от инактивации Rho [34]. Активация секреции ИЛ-8 зависела от способности TcdA поступать в чувствительные клетки и активировать NF-kB и AP-1. Кроме того, имеются наблюдения, что ИЛ-11 способен ингибировать TcdA-обусловленные повреждения путем блокирования высвобождения таких медиаторов воспаления, как ФНОа и макро-фагальный воспалительный протеин-2 [35]. Оказалось, что фактор, усиливающий кишечную секрецию, индуцированную TcdA, синтезируется кишечными макрофагами посредством ИЛ-ф-зависимого механизма, который, возможно, также играет важную роль в развитии воспаления при инфекции C. dif. Дополнительно к инфильтрации слизистой оболочки нейтрофилами, макрофаги и тучные клетки также отвечают на TcdA, содействуя развитию воспалительной реакции через ФНОа [32]. И все же апоптоз является конечным результатом действия TcdA и TcdB на все клетки-мишени, хотя окончательно механизм его индукции и пути развития продолжают интенсивно изучаться. Исследования на линиях эпителиальных клеток кишечника показали, что механизм развития апоптоза проходил через активацию каспаз 3, 6, 8, 9 и активацию Bid с последующим нарушением потенциала митохондриальной мембраны и высвобождением цитохрома С [6]. В то же время имеются наблюдения, что TcdA способен индуцировать апоптоз независимо от инактивации Rho-белка. Так, обработка эпителиальных клеток TcdA приводила к его накоплению в митохондриях уже через 5 мин от начала экспозиции, что предшествовало гликозилированию Rho-белков. Это наблюдение свидетельствует, что апоптоз может быть индуцирован путем разрушения митохондрий, что служит промотором последующих проапопто-тических изменений [36]. TcdB также способен индуцировать апоптоз. Исследованиями на клетках HeLa установлено, что TcdB может индуцировать апоптоз двумя путями: каспазазависимым и каспазанезависимым [28]. Первый путь реализуется через активацию каспазы-3 и протекает с параллельной потерей клеткой ви-ментина (промежуточного филамента), играющего важную роль в интеграции клеточных структур и поддержании морфологии клетки, тогда как каспа-занезависимый путь опосредован специфической инактивацией субстрата. Клиническая картина заболевания, вызванного C. dif., характеризуется широким диапазоном проявлений: от легкой, кратковременной и самокупи-рующейся диареи до тяжелого поражения преимущественно толстой кишки с формированием язв и эрозий, покрытых фибринозным налетом, что эндоскопистами описывается как псевдомембранозные наложения, что собственно и дало основание обозначать самую тяжелую форму заболевания как ПМК. Патоморфологические изменения, выявляемые в слизистой оболочке толстой кишки, характеризуются развитием выраженного воспаления, которое, вероятно, обусловлено локальным действием TcdA и TcdB. Во всяком случае на экспериментальных животных с использованием токсинов моделировался процесс, идентичный тому, что выявляется у людей с ПМК [37]. Поскольку TcdA в большей степени демонстрировал способность к аккумуляции жидкости в лигиро-ванной петле кишечника лабораторных животных, экспериментальные исследования преимущественно проводились именно с этим токсином. В число наиболее важных эффектов входят: индукция воспаления, повышение проницаемости эпителиальных клеток, разрушение плотных эпителиальных соединений, продукция цитокинов и хемокинов, инфильтрация слизистой оболочки ПМЯЛ, продукция кислородных радикалов, активация тучных клеток [33], прямое повреждение клеток слизистой оболочки кишечника, подобно тому, что наблюдается у больных с ПМК. Описанные эффекты способствуют рекрутированию нейтрофилов в зону воспаления, их прямому взаимодействию с TcdA и индукции выработки медиаторов воспаления. На экспериментальной модели (кролики) было установлено, что TcdA связывается с нейтрофилами посредством, вероятно, рецептора, подобному G-белку. Кроме того, было установлено, что блокирование молекул адгезии лейкоцитов (CD18) предотвращало TcdA-индуцированную миграцию нейтрофилов. В развитии воспаления определенное значение имеют экспрессия макрофагального воспалительного протеина-2, а также рецепторы к нему и хемокин ŒR1. Интересные результаты исследований были получены при изучении синергизма действия TcdB и ЛПС на выработку ФНОа и экспрессию CD14 моно-нуклеарными фагоцитами. Воздействие на моноциты TcdB уже через 5 ч экспозиции приводило к сверхэкспрессии CD14 с тенденцией к снижению этого показателя по истечении 24 ч. Макрофаги при идентичных условиях демонстрировали сохранение сверхэкспрессии даже после 24 ч. На основании исследований авторы заключают, что модуляция экспрессии CD14 зависит от статуса дифференцировки 45 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ, № 6, 2013 клетки и, возможно, от состояния активации [38]. Частота выявления штаммов C. dif., не вырабатывающих TcdA-штаммы, из клинических образцов составляет около 11%, однако обращают на себя внимание и другие данные [39], согласно которым происходит неуклонный рост высева не вырабатывающих TcdA от больных с тяжелым течением заболевания. По сути сложившаяся ситуация требует проведения дополнительных клинических исследований, способствующих объяснению патогенеза инфекции C. dif. без участия TcdA. Данная ситуация представляется еще более интригующей, если учитывать данные о том, что один TcdB (без предварительного введения TcdA) не проявляет своей активности и не способен вызвать повреждения слизистой оболочки кишечника [40]. В то же самое время сравнительный анализ клинического течения заболеваний, вызванных TcdA-продуцирующими и не продуцирующими штаммами C. dif., не показал никаких существенных различий [12]. Хотя в большинстве клинико-экспериментальных исследований особое внимание уделялось TcdA как ведущему фактору патогенности C. dif. В последующем было опубликовано значительное количество клинических наблюдений, в которых указывалось об изоляции от больных штаммов C. dif., вырабатывающих только один TcdB, в том числе и от больных с клинической картиной тяжелого ПМК. Таким образом, современная ситуация характеризуется сменой циркулирующих клонов C. dif. с широким распространением штаммов, не продуцирующих один из ведущих факторов патогенности, а именно TcdA [41]. Более того, в разных странах мира были зарегистрированы крупные внутрибольничные вспышки диарейных заболеваний, обусловленные C. dif., недостаточно продуцирующие токсины А и В и бинарный токсин [42-44]. Среди методов детекции TcdA и TcdB C. dif. следует отметить следующие: стандартный токсигенный культуральный метод, illumigene“" loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay (Meridian), Vidas C. difficile A&B (VIDAS-CDAB), RIDASCREENr enzyme immunoassay (EIA) (R-Biopharm), C. difficile Quik Chek (Techlab), C. difficile Tox A/B ІІ EiA Кії (Techlab), Triage panel, Culturette brand rapid latex test for C. difficile toxin A, диагностикумы для выявления токсинов А и В C. difficile в РКА на планшетах, ImmunoCard Toxins A&B, Premier toxin A&B [2, 7, 11, 45-49]. К сожалению, большинство госпитальных и муниципальных лабораторий не имеют возможности проводить исследования по обнаружению токсинов C. dif., что ограничивает возможности истинной оценки распространения этого заболевания в РФ. По этой причине в литературе мало представлены клинические наблюдения, посвященные изучению влияния определяемых токсинов на особенности течения заболеваний, обусловленных C. dif. [2]. Необходимость более четкого определения роли и значения БТ в патогенезе инфекционных заболева ний требует продолжения разработки и усовершенствования методов их диагностики, открывает принципиально новые возможности в лечении и профилактике заболеваний, вызываемых C. difficile.

About the authors

N. M Gyulazyan

Yerevan State Medical University after Mkhitar Heratsi

Email: g.naira@rambler.ru

O. F Belaya

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: ofbelaya@mail.ru

V. A Malov

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: valmalov@list.ru

S. G Pak

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: infection_mma@mail.ru

References

Supplementary files