Experience of application of ELISA test kids for the serological diagnosis of West Nile fever

Full Text

Серологическая диагностика арбовирус-ных инфекций проводилась в Астраханской области с 1997 по 2013 г. в вирусологической лаборатории Центра гигиены и эпидемиологии (ЦГиЭ). В 1997-2011 гг. для этой цели использовали иммуноферментные (ИФА) тест-системы производства НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского (Москва), предназначенные для выявления специфических IgM в сыворотках крови больных [1]. В 2013 г. вирусологическая лаборатория ЦГиЭ перешла на применение ИФА-IgM системы ЗАО БТК «Биосервис» (РУ № ФСР 2012/13840 от 10.09.12), которая является коммерческим аналогом тест-системы НИИ вирусологии. В период с 1997 по 2013 г. в лаборатории было обследовано 13 863 сыворотки (а также пробы СМЖ) от 8464 больных с острыми сезонными лихорадочными заболеваниями с предварительными диагнозами: ОРВИ, серозный менингит, Крымская геморрагическая лихорадка, Астраханская риккетсиозная лихорадка, ВИНЭ, лихорадка Ку и др. В результате этой работы было верифицировано 544 случая лихорадки Западного Нила (ЛЗН), включая 95 случаев в 1999 г. Тест-системы ИФА-IgM НИИ вирусологии (до 2012 г.) и ЗАО «Биосервис» (в 2012 и 2013 гг.) были апробированы и с успехом применялись также в вирусологических лабораториях ЦГиЭ в Волгограде, Ростове-на-Дону и Краснодаре. При использовании этих диагностикумов предусматриваются обязательные положительные (К+) и отрицательные (К-) контроли, а также параллельное обследование сывороток со специфическим и нормальным антигенами. Учет реакции осуществляется на спектрофотометре при длине волны 450 нм. Положительными считаются пробы сывороток со следующими параметрами: оптическая плотность (ОП) в лунках со специфическим антигеном выше 0,350 о. е.; ОП в лунках со специфическим антигеном превышает ОП с нормальным антигеном в 3 раза и более. Все сыворотки, положительные при первичном скрининге в разведении 1:100, тестируются повторно для определения титра антител. Диагностическим считается титр IgM > 1:800 (согласно МУ 3.1.3.2600 - 10 «Мероприятия по борьбе с лихорадкой Западного Нила (ЛЗН) на территории Российской Федерации»). Выявление специфических IgM возможно в первые дни заболевания, что позволяет проводить экспресс-диагностику ЛЗН сразу после госпитализации больных. При обследовании парных сывороток регулярно обнаруживается диагностически значимая сероконверсия IgM [1, 3]. Результаты тестирования в ИФА-IgM полностью подтверждаются Для корреспонденции: Алла Рудольфовна Азарян, зав. вирусологической лаб. ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Астраханской области», e-mail: marineazaryan@mail.ru Таблица 1 Результаты обследования сывороток крови 5 больных из ОИКБ в ИФА-тест-системах Euroimmun и Биосервис на антитела к вирусу ЗН Диагностические лаборатории Номер сыво Больные День обсле дования от ОИКБ, Астрахань ЦгиЭ, Астра ханской области Волгоградский НИПЧИ ротки начала заболе- тест-системы ИФА вания Euroimmun Биосервис Euroimmun IgM IgM IgM IgG 127 Х.М. 14 +* (R±2,18) 0** 0 0 159 31 н/о *** 0 0 0 128 К. 3 + (R-2,56) 0 0 0 221 31 н/о 0 0 0 129 Я. 5 + (R-1,8) 1:800 ± (R-1,04) +(R-2,02) 133 10 +(R-1,84) 1:800 + (R-1,28) (R-1,92) 130 Х.А. 14 +(R-2,4) Отр. +(R-1,75) 0 180 28 н/о Отр. н/о н/о 131 Р.Н. 4 +(R-1,83) Отр. Погранич. ± (R-0,99) 0 Контроль IgM+ н/о н/о + н/о н/о Примечание. Здесь и в табл. 2: R - Ratio; * + - положительный результат; ** 0 отрицательный результат; *** н/о - не обследованы. данными ИФА-IgG [3]. При учете результатов реакции рассчитывается отношение (Ratio) ОП в лунках с сыворотками больных к ОП в лунке с калибратором. Результат считается положительным при Ratio > 1,1, отрицательным при Ratio < 0,8, пограничным (сомнительным) в интервале от 0,8 до 1,1. В период с 17 мая по 3 июля 2013 г. в лаборатории ОИКБ с использованием наборов Anti-West Nile virus (IgM) фирмы Euroimmun AG были обследованы сыворотки 535 госпитализированных больных. 16 проб от 15 больных с положительным результатом ИФА на IgM-антитела к вирусу ЗН были направлены в вирусологическую лабораторию ЦГиЭ для подтверждения диагноза (согласно МУ 4.2.3009 - 12 «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики ЛЗН для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней»). Первые 6 сывороток от 5 больных поступили 29 мая. Раннее появление больных в мае-середине июня вызвало настороженность, так как предшествующими многолетними исследованиями было установлено, что первые случаи ЛЗН в Астраханской области появляются в конце июня и регистрируются до октября месяца, а пик заболеваемости приходится на август-сентябрь [1, 2]. При проверке в лаборатории ЦГиЭ из 6 сывороток, положительных в тест-системе Euroimmun AG, позитивными в тест-системе ЗАО «Биосервис» оказались только две (№ 129 и 133), взятые у больной Я. на 5-й и 10-й дни заболевания. При этом титр IgM антител в обеих пробах составил 1:800. Результаты обследования четырех сывороток (№ 127, 128, 130, 131), а также 60 Таблица 2 Результаты обследования сывороток 11 больных из ОИКБ в ИФА-тест-системах Euroimmun и Биосервис на IgM антитела к вирусу ЗН Номер сыворотки Боль ные День обследования от начала заболевания Диагностические лаборатории ОИКБ, Астрахань ЦгиЭ, Астраханской области 174 К. 1 +* (R-7,84) 0** 215 11 н/о*** 0 175 Г. 7 + (R-2,5) 0 182 12 н/о 0 176 И. 1 + (R-2,4) 0 184 8 н/о 0 177 Л. 11 + (R-1,9) 0 178 Ч. 4 + (R-7,0) 0 198 А.А. 9 + (R-2,19) 0 275 25 н/о 0 199 д.д. 8 + (R-7,0) 0 213 12 н/о 0 245 А.Д. 3 + (R-9,5) 0 244 7 н/о 0 247 С. 6 + (R-3,5) 0 258 11 н/о 0 248 Н. 9 + (R-1,6) 0 181 Д.Е. 7 + (R-1,7) 0 249 18 н/о 0 Контроль н/о + IgM+ проб, полученных от больных Х.М., К. и Х.А. в более поздние сроки (через 31, 31 и 28 дней от начала болезни) были отрицательными (табл. 1). В связи с расхождением полученных данных 04.06.13 г. 6 образцов сывороток были направлены в Волгоградский противочумный институт (являющийся Референс-центром Роспотребнадзора по мониторингу за возбудителем ЛЗН) для проведения дополнительного обследования на IgM- и IgG-антитела к вирусу ЗН, выполненного с использованием тест-систем Euroimmun. В этом случае положительными оказались сыворотки № 133 (на IgM- и IgG-антитела) и № 130 (на IgM при отсутствии IgG), сомнительными на IgM - № 129 и 131 (при отрицательном результате обследования на IgG) (см. табл. 1). Таким образом, с применением наборов Euroimmun диагноз ЛЗН был установлен в 5 случаях в лаборатории ОИКБ Астрахани и в 2 случаях в лаборатории Волгоградского НИПЧИ, а с использованием тест-системы «Биосервис» (в лаборатории ЦГиЭ) только в одном случае. Эти данные свидетельствуют о ложноположительном характере выявления IgM-антител в сыворотках № 127, 128, 130, и 131 с помощью диагностикума Euroimmun. В июне 2013 г. из ОИКБ в вирусологическую лабораторию ЦГиЭ поступили еще 11 сывороток от 11 больных, позитивных на IgM-антитела к вирусу ЗН (по данным обследования в тест-системе Euroimmun). Все эти пробы, так же как и 8 других, взятых у больных той же группы в более поздние сроки (на 8-25-й день от начала заболевания), оказались отрицательными в тест-системе ЗАО «Биосервис» (табл. 2). Таким образом, на первом этапе нашей работы серологически было обследовано 16 больных, госпитализированных в ОИКБ Астрахани. Даты их заболевания приходились на период с 6 мая по 29 июня 2013 г. Диагнозы при госпитализации: вирусный менингит и менингит в 5 случаях, вирусная инфекция неясной этиологии в 4 случаях, Астраханская риккетсиозная лихорадка у 3, ОРВИ у 3, аденовирусная инфекция в 1 случае. Возрастное распределение: 1-8 лет - 11; 17 лет - 2; 48-51 год - 3. Дети в возрасте от 1 года до 5 лет были госпитализированы с диагнозами: менингит (4), ВИНЭ (1), ОРВИ (1). Совпадение результатов обследования этой группы пациентов с применением ИФА-тест-систем производства Euroimmun AG и ЗАО Биосервис для выявления IgM-антител к вирусу ЗН составило всего 6,2%. С учетом этих данных ОИКБ в июле 2013 г. приобрела тест-системы БиоСкрин-ВЗН производства компании ЗАО Биосервис, с помощью которых было обследовано 1109 пациентов, при этом IgM-антитела к вирусу ЗН выявлены у 33. При обследовании сывороток крови этих больных в вирусологической лаборатории ЦГиЭ этот результат подтвердился в 32 (97%) случаях. На основании полученных данных можно сделать заключение, что использованные в работе тест-системы Anti-West Nile virus ELISA-IgM производства фирмы Euroimmun AG не отвечают требованиям специфичности и они не должны применяться для диагностики ЛЗН.

About the authors

A. R. Azaryan

Center of Hygiene and Epidemiology in the Astrakhan region

Email: marineazaryan@mail.ru

A. P. Grishanova

Center of Hygiene and Epidemiology in the Astrakhan region

E. I. Ivashchenko

Center of Hygiene and Epidemiology in the Astrakhan region

G. L. Shendo

Center of Hygiene and Epidemiology in the Astrakhan region

A. I. Kovtunov

Rospotrebnadzor Manage ment in Astrakhan region

S. ZH. Netalieva

A. Nichogy region infection hospital

M. A. Babaeva

A. Nichogy region infection hospital

A. V. Burkin

A. Nichogy region infection hospital

T. E. Arshba

A. Nichogy region infection hospital

V. F. Larichev

D.I. Ivanovsky Institute of Virology

A. M Butenko

D.I. Ivanovsky Institute of Virology

References

Supplementary files