INDEL-GENOTYPING OF VIBRIO CHOLERAE STRAINS

Full Text

Выявление различных генетических маркеров у штаммов холерных вибрионов является полезным приемом при проведении эпидемиологических расследований, дающим возможность выявлять связи между различными изолятами, что в свою очередь позволяет делать выводы об источниках завозов возбудителя на конкретную территорию [1]. При этом в последнее десятилетие определение кратности 5 локусов вариабельных тандемных повторов стало фактически стандартом генотипирования штаммов Vibrio cholerae [2-4]. Вместе с тем при VNTR-типировании ряда других возбудителей особо опасных инфекций используется более широкий набор локусов. Так, для генотипирования возбудителя туляремии используется определение кратности 25 [5], а для возбудителя чумы - 42 VNTR-локуса [6], что делает актуальными работы по поиску новых генетических маркеров, пригодных для проведения быстрого анализа штаммов возбудителя холеры. Одним из перспективных способов генотипирования является метод INDEL-типирования, основанный на определении вставок-делеций (INsertion-DELetion) в различных генах, что позволяет выявлять индивидуальные различия между штаммами. Ранее уже была показана возможность использования INDEL-типирования для изучения штаммов холерного вибриона, выделенных из объектов окружающей среды, что позволило осуществить географическую привязку ряда генотипов [7]. Однако это исследование проводилось с использованием всего лишь 4 INDEL-локусов и включало только атоксигенные (ctxAB-) штаммы холерного вибриона. В связи с этим цель настоящего исследования состояла в сравнительном INDEL-типировании по 9 локусам представительной коллекции штаммов холерного вибриона, включающей как музейные токсигенные штаммы холерного вибриона сероваров О1 и О139, так и штаммы, выделенные из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации в последние годы. Материалы и методы В работе использовали 14 ctx+tcp+ штаммов классического биовара, выделенных с 1927 г., и 22 ctx+tcp+ штамма биовара Эльтор, выделенных в 1981-2014 гг., шесть ctx+tcp+ штаммов серовара О139, а также 181 штамм серовара О1, выделенных в 2014-2016 гг. на территории Российской Федерации из объектов внешней среды при проведении мониторинга холеры. Для проведения INDEL-типирования удалось отобрать 9 INDEL-локусов, к которым были сконструированы специфические праймеры (табл. 1). Постановку полимеразной цепной реакции (ПЦР) и учет результатов проводили, как описано ранее [7]. Вариабельность оценивали с помощью индекса разнообразия Симпсона (diversity index, DI), раcсчитываемого по формуле [8]: DI = 1 - ∑ (частота аллели2). Кластерный анализ и построение дендрограммы проводили с использованием авторского программного обеспечения по методу UPGMA. Для построения дендрограммы использовали программу MEGA 5 [9]. В работе использованы данные полногеномного секвенирования штаммов Vibrio cholerae Эльтор O1 № 18899 и P18899-D, полученные из системы GenBank. Анализ данных полногеномного секвенирования проводили с помощью программы Virtual PC [10]. Результаты и обсуждение Проведение генотипирования по 9 INDEL-локусам позволило выявить среди включенных в исследование 223 штаммов 31 уникальный генотип. На основе кластерного анализа все генотипы были сгруппированы в 9 кластеров, обозначенных буквами латинского алфавита с «А» по «I» (см. рисунок). Обращает на себя внимание, что все токсигенные штаммы серовара О1 классического биовара были представлены одним INDEL-генотипом А5, в то время как все токсигенные штаммы О1 Эльтор и О139 представлены другим INDEL-генотипом - А1 (табл. 2). При этом различия между генотипами А5 и А1 обусловлены изменениями в двух INDEL-локусах - 2456 и р1070, что указывает на относительную генетическую близость штаммов О1 Эльтор и О139. Учитывая, что для токсигенных штаммов вибрионов, выделенных в сравнительно короткий период, характерно наличие множества VNTR-генотипов (Онищенко Г.Г., 2016), стабильный INDEL-генотип у всех изученных токсигенных штаммов, изолированных с разрывом в десятки лет, свидетельствует о высоком генетическом консерватизме выбранных INDEL-локусов по сравнению с VNTR-локусами. На наш взгляд, этот факт делает нецелесообразным INDEL-типирование ctx+tcp+ вибрионов. Кроме того, в состав кластера А вошли 8 ctx-tcp+ штаммов, выделенных на территории РФ в 2015-2016 гг., которые сформировали три INDEL-генотипа: А2-А4. Нахождение в одном кластере штаммов ctx+tcp+ и ctx-tcp+ может свидетельствовать в пользу общности их происхождения и отличия от ctx-tcp- штаммов. Поскольку используемые нами INDEL-маркеры не входят в состав острова патогенности VPI-1, кодирующего продукцию токсин-корегулируемых пилей, выявленный факт позволяет предположить, что сtx-tcpA+ штаммы холерного вибриона составляют обособленную популяцию, существенно отличающуюся от tcpA- штаммов. Это предположение также подтверждается обнаружением вариабельного тандемного повтора VcB только у tcpA+ штаммов [11]. Таким образом, по результатам INDEL-типирования можно судить о наличии у изученного штамма генов ctx и tcp. Вместе с тем выявленный консерватизм INDEL-локусов представляется весьма важным в свете возможности утраты штаммами холерного вибриона профага CTX [12, 13]. Очевидно, что поскольку изучаемые локусы не затрагивают область генома, содержащую гены холерного токсина (профаг CTX), то их утрата не повлечет за собой изменение INDEL-генотипа. Для проверки этого предположения нами изучены данные полногеномного секвенирования токсигенного штамма V. cholerae № 18899 и штамма V. cholerae Р18899-D, представляющего собой его изогенный мутант, спонтанно утративший ген холерного токсина [13]. При этом оба изолята имели идентичный генотип, характерный для токсигенных штаммов. Это позволяет рекомендовать метод INDEL-типирования для выявления атоксигенных штаммов холерного вибриона, имевших в прошлом профаг CTX. На наш взгляд, выделение таких штаммов из объектов внешней среды позволяет предположить одновременную циркуляцию и «исходного» (токсигенного) изолята, что требует проведения большего объема проводимых противоэпидемических мероприятий. Небезынтересно отметить, что при изучении коллекции атоксигенных штаммов, выделенных за последние 3 года на территории России, не удалось выявить ни одного подобного изолята, утратившего ген холерного токсина. Также нам не удалось найти упоминания о подобном феномене в зарубежной литературе, что позволяет сделать вывод о редкости этого явления. При анализе 173 ctx-tcp- штаммов, выделенных в 2014-2016 гг. на территории Российской Федерации из объектов внешней среды, выявлено 26 INDEL-генотипов, сформировавших 8 кластеров, обозначенных буквами латинского алфавита с «В» по «I» (табл. 3, рисунок). Анализ пространственного распределения выявленных INDEL-кластеров обнаружил довольно интересные закономерности. Кластер B был представлен в основном штаммами из Ростовской области и Республики Калмыкия. Исключение составил один штамм, выделенный в Челябинской области в 2016 г. При этом нужно обратить внимание на выделение штаммов одних и тех же генотипов в разные годы. Так, штаммы генотипа B4 выделялись в 2014 и 2016 гг. как в Ростовской области, так и в Республике Калмыкия. Небольшой кластер C образован штаммами из Республики Калмыкия и одним штаммом из Крыма. Небезынтересно отметить, что в Республике Крым циркулировали штаммы из двух разных кластеров (C1 и F2), причем места их выделения находятся на значительном удалении друг от друга и не имеют единого водного сообщения (данные не представлены). Штаммы кластера D выделяли в 10 регионах из 16. Удивительно, но к данному кластеру относятся все штаммы, выделенные в Забайкальском крае, Иркутской, Калининградской, Псковской, Рязанской областях, Республиках Татарстан и Бурятия. К этому же кластеру относятся 3 из 4 штаммов, выделенных в Приморском крае. Кластер E был представлен лишь одним штаммом, изолированным из реки Дон (Ростовская область) в 2015 г. 80 штаммов, выделенных из реки Агура (Краснодарский край) в 2015 г., имели идентичный INDEL-генотип F1. Интересно, что к этому же генотипу относился штамм холерного вибриона, выделенный в Челябинской области в 2015 г. В кластер F попали также штаммы, выделенные в Республике Крым в 2014 г., и один штамм из Приморского края (2014 г.). Кластер G образован штаммами, изолированными в Республике Калмыкия (генотипы G1, G2, G4 и G5) и Свердловской области (генотип G3). Кластеры H и I образованы исключительно штаммами из Республики Калмыкия. Не меньший интерес представляет изучение генетической вариабельности выделяемых штаммов холерного вибриона. Так, индекс разнообразия Симпсона, рассчитанный для изученной коллекции штаммов, составил 0,76, что может свидетельствовать о высокой степени гетерогенности популяции. Интересные результаты получены при изучении вариабельности штаммов по каждому региону в отдельности (см. табл. 3). Так, для ряда регионов индекс разнообразия равен нулю (генетическое разнообразие отсутствует). На наш взгляд, отсутствие генетического разнообразия среди выявляемых вибрионов может свидетельствовать о том, что попадание вибрионов в водные объекты является случайным событием, что подтверждается отсутствием выделения штаммов в предыдущие и последующие годы. И наоборот, для регионов с ежегодным выделением штаммов характерен более высокий индекс разнообразия популяции. Необходимо отметить, что связь между внутривидовым разнообразием и эпидемиологической опасностью уже установлена на примере ряда других возбудителей. Так, внутривидовая изменчивость возбудителя чумы в естественных условиях коррелирует со стадиями эпизоотического процесса, когда наибольшее количество измененных форм выявляется в фазу острой эпизоотии [14]. Аналогичные данные получены при изучении генетического разнообразия шигелл Зонне - увеличение гетерогенности их популяции четко коррелирует с подъемом заболеваемости [15]. При этом некоторыми авторами генетическое разнообразие популяции возбудителя рассматривается как приспособительный признак, обеспечивающий адаптацию к условиям окружающей среды [16]. Вышеизложенное позволяет рекомендовать использование индекса разнообразия в качестве одного из критериев для оценки эпидемиологического риска. Заключение Таким образом, в ходе проведенного исследования установлено, что INDEL-типирование является полезным инструментом для изучения молекулярной эпидемиологии, позволяющим выявлять особенности территориального распределения различных генотипов штаммов холерного вибриона. При этом токсигенные штаммы холерного вибриона имеют генотипы, отличающиеся от генотипов атоксигенных штаммов. Показано, что INDEL-типирование позволяет выявлять атоксигенные штаммы, имевшие в прошлом гены холерного токсина. Подтверждено высказанное ранее предположение о территориальной приуроченности ряда генотипов. Установлено, что при ежегодном выделении штаммов холерного вибриона из одних и тех же объектов окружающей среды их популяция отличается высоким уровнем генетического разнообразия даже при небольшом количестве выделяемых штаммов, что позволяет предложить использование индекса разнообразия в качестве одного из критериев для оценки эпидемиологического риска.

About the authors

Aleksey S. Vodop’yanov

Rostov-on-Don Anti-Plague Institute, Federal Service for Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

Email: alexvod@gmail.com
MD, PhD, head of the virology group of the Rostov-on-Don Anti-Plague Institute, Federal Service for Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision, 117, Gorky Street, Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation 117, Gorky Street, Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

S. O Vodop’yanov

Rostov-on-Don Anti-Plague Institute, Federal Service for Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

117, Gorky Street, Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

I. P Oleynikov

Rostov-on-Don Anti-Plague Institute, Federal Service for Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

117, Gorky Street, Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

B. N Mishan’kin

Rostov-on-Don Anti-Plague Institute, Federal Service for Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision

117, Gorky Street, Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation

References

Supplementary files