DETECTION OF BORRELIA INFECTION BY AN INNOVATION TEST SYSTEM (IMMUNOCHIP) IN PATIENTS WITH SCLEROATROPHIC LESIONS OF THE SKIN

Full Text

Иксодовый клещевой боррелиоз — ИКБ (син. Лайм-боррелиоз) — природно-очаговое мульти-системное воспалительное заболевание, вызываемое спирохетами рода Borrelia, переносчиками которых являются иксодовые клещи [4, 6, 13]. Возбудители ИКБ входят в группу Borrelia burgdorferi sensu lato, насчитывающую 14 геновидов, из которых патогенными для человека являются три: B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii [5, 6, 13, 15]. При развитии боррелиозной инфекции поражаются многие органы и системы, что проявляется широким спектром клинических проявлений. Маркером ранней локализованной (I) стадии ИКБ является мигрирующая эритема Авцелиуса — Липщютца в месте присасывания клеща. Другие патогномичные признаки поражения кожи — боррелиозная лимфоцитома как проявление ранней диссеминированной (II) стадии и хронический атрофический акродерматит как проявление поздней диссеминированной (III) стадии. К сожалению, другие клинические симптомы поражения кожи редко имеют диагностическое значение [4, 6, 7, 13, 15]. В настоящее время широко обсуждается роль геновидов B. garinii и B. afzelii в развитии таких склероатрофических поражений кожи, как бляшеч-ная склеродермия, атрофодермия Пазини—Пьерини, склероатрофический лихен [3, 6]. В отличие от многих бактериальных инфекций прямые методы обнаружения возбудителя для подтверждения ИКБ широко не используют. Боррелии трудны для культивирования in vitro, а частота выделения возбудителя из клинического материала низка (за исключением кожи из участков мигрирующей эритемы) [1, 2, 5, 7, 14]. Как правило, лабораторные методы диагностики ИКБ основаны на определении антител к белкам боррелий. К ним относят реакцию непрямой иммунофлюоресценции, иммунофермент-ный анализ, иммунный блоттинг [5, 7, 9]. Иммунный блоттинг является современным высокоинформативным способом выявления антиборрелиозных антител, характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет выявлять специфические антитела к определенным белкам микроорганизма [1, 3, 5, 6, 8]. С целью повышения диагностической точности Американский центр контроля болезней предложил подтверждать положительные или сомнительные результаты первичных серологических тестов с помощью иммунного блоттинга, причем серологическое тестирование считают положительным, если при исследовании одной и той же сыворотки скрининговый метод и иммунный блот-тинг дали положительные результаты [1, 2, 5, 8—12]. В ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора разработана диагностическая тест-система в формате иммуночипа, которая позволяет в одной постановке дифференциально выявлять широкий спектр антител классов G (IgG) и M (IgM) к различным антигенам боррелий B. afzelii и B. garinii — геновидам, наиболее распространенным в Российской Федерации. В состав иммуносорбента включены 14 антигенов: p100 B. garinii, p100 B. afzelii, VlsE B. afzelii, VlsE B. garinii, p58 B. afzelii, p41 B. garinii, p41 B. afzelii, р39 B. afzelii, ВВК32 B. garinii, ВВК32 B. afzelii, OspC B. garinii, OspC B. afzelii, p17 B. garinii, p17 B. afzelii (всего 8 групп антигенов — p100, VlsE, р58, р41, р39, ВВК32, OspC, р17), которые иммобилизованы в пределах каждого эррея в виде индивидуальных спотов (микроточек) в повторах на твердой фазе — микроскопных слайдах шириной 25 ± 1 мм, длиной 75 ± 1 мм и толщиной 1 мм с модифицированной химической поверхностью. На одном слайде 12 индивидуальных эрреев. Один эррей служит для постановки одного клинического или контрольного образца. Диагностическая тест-система в формате иммуночипа представляет собой набор реагентов, который помимо иммуносорбента включает растворы для разведения контрольных и исследуемых образцов, концентрата конъюгата, для промывки иммуносорбента, а также положительный и отрицательный контрольные образцы. На первой стадии в эрреях иммуносорбента проводят инкубацию клинических/контрольных образцов. Имеющиеся специфичные антитела к боррелиям классов G и M связываются с антигенами на иммуносорбенте. На второй стадии связавшийся иммунный комплекс антиген—антитело выявляют с помощью инкубации с конъюгатом, представляющим собой смесь меченных флюорофорами вторичных антител к иммуноглобулинам человека классов G и М. Одновременное и дифференциальное обнаружение антител различных классов возможно благодаря использованию конъюгата, состоящего из смеси антител к IgG человека, меченных флюорофором Cy5, и антител к IgM человека, меченных флюорофором Cy3, и учету результатов с помощью многоканального флюоресцентного сканера (например, с помощью систем MarS, GeSim, Германия) при активации соответствующих каналов. Таким образом, на канале Су5/Я^ детектировали специфические IgG, на канале Cy3/Green — специфические IgM. Для каждого спота рассчитывают коэффициент К, представляющий собой отношение абсолютного значения флюоресценции конкретного спота (за вычетом суммарного фона вокруг эррея). Значение критического уровня (cut off) для каждого из антигенов устанавливают путем умножения среднего значения коэффициента К в эррее с внесенным контрольным отрицательным 33 РОССИЙСКИЙ ЖУРНАЛ КОЖНЫХ И ВЕНЕРИЧЕСКИХ БОЛЕЗНЕЙ Таблица 1 Критерии интерпретации результатов на наличие/отсутствие IgM Результат отрицательный положительный неопределенный (сомнительный) • Антитела ко всем 14 антигенам отсутсвуют • Наличие антител к антигену p17 и/или p100 при отсутствии антител к остальным антителам • Выявлены антитела к белку OspC • Выявлены антитела как минимум к двум антигенам из группы: p41, VlsE, p17 • Выявлены антитела только к одному антигену из группы: p58, p41, p39, BBK32, VlsE образцом тест-системы (К-) на 2. Для каждого иммобилизованного антигена рассчитывают коэффициенты позитивности (КП) антител как отношение среднего значения К к соответствующему cut off. Положительным результатом на наличие антител к определенному антигену в исследуемом образце считают те показатели, при которых КП больше или равен 1,1. Далее проводят дифференциальную диагностику антител к ИКБ в соответствии с инструкцией по применению к тест-системе. Критерии интерпретации результатов проведенного анализа с использованием вышеописанного иммуночипа представлены в табл. 1, 2. При наличии неопределенного результата или с целью динамического наблюдения за развитием болезни, а также за результатами лечения болезни Лайма рекомендуют повторное тестирование в иммуночипе нового образца сыворотки/плазмы крови человека через 1—3 мес одновременно с постановкой образца, взятого ранее и хранившегося при температуре не выше -16°С. Тест-систему для серологическогой диагностики ИКБ в формате иммуночипа мы использовали с целью подтверждения боррелиозной этиологии склероатрофических поражений кожи. В отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского с 2009 по 2011 г. мы обследовали 237 пациентов с различными склероатрофическими поражениями кожи: у 183 (77%) диагностировали бляшеч-ную склеродермию, у 33 (14%) — склероатрофический лихен, у 15 (6%) — атрофодермию Пазини—Пьерини, у 6 (3%) — хронический атрофический акродерматит. У 35 (15%) больных выявили положительные результаты в иммуночипе. Среди них у 22 (63%) диагностировали бляшечную склеродермию, у 6 (17%) — хронический атрофический акродерматит, у 4 (11%) — атрофодермию Пазини—Пьерини, у 3 (9%) — склероатрофический лихен. Из 35 серопозитивных больных 32 (91%) женщины и 3 (9%) мужчины, в том числе в возрасте от 20 до 30 лет 4 (12%), от 31 года до 40 лет 2 (6%), от 41 года до 50 лет 3 (8%), от 51 года до 60 лет 13 (37%), от 61 года до 70 лет 10 (28%), старше 71 года 3 (8%). Факт присасывания клеща в анамнезе установили у 10 (28%) больных. Анамнез заболевания составлял от 3 мес до 20 лет. Поражения кожи носили распространенный характер у 28 (80%) больных, и лишь у Таблица 2 Критерии интерпретации результатов в иммуночипе на наличие/отсутствие IgG Результат отрицательный положительный неопределенный (сомнительный) • Антитела ко всем 14 антигенам отсутствуют • Наличие антител к антигену p17 при отсутствии антител к остальным антигенам • Выявлены антитела к белку VlsE • Выявлены антитела как минимум к двум антигенам из группы: p100, p58, p41, p39, BBK32, OspC, p17 Выявлены антитела только к одному антигену из группы: p100, p58, p41, p39, BBK32, OspC 7 (20%) отметили единичные (1—3) очаги. Кожный счет по Родману варьировал от 1 до 28 баллов (I—II степень тяжести процесса), индекс активности составил 2—3 балла, индекс склероза — 1—2 балла. При обследовании астеноневротическое состояние выявили у 11 (31%) пациентов, поражение опорнодвигательного аппарата — у 13 (37%), нервной системы — у 14 (40%), сердечно-сосудистой системы — у 5 (14%), субфебрильную температуру — у 7 (20%). В группе из 35 больных специфические антитела класса М обнаружили в иммуночипе у 12 (34%), при этом наблюдали положительную иммунореактивность к 2—3 группам антигенов боррелий. Наиболее часто детектировали антитела к белкам OspC, p17, p41. Серопозитивные значения по IgG выявили у всех 35 пациентов, при этом определили от 3 до 8 групп антигенов (табл. 3). Следует отметить, что наиболее полный спектр антител был представлен при хроническом атрофическом акродерматите (8 групп антигенов) и бляшечной склеродермии (7 групп антигенов), что позволяет судить о сходном механизме иммунопатогенеза при развитии данных процессов или одинаковой стадии ИКБ у этих больных. Учитывая небольшую выборку серопозитивных пациентов с атрофодермией Па-зини—Пьерини и склероатрофическим лихеном (4 и 3 соответственно), полагаем необходимым продолжить Таблица 3 Выявляемые группы антигенов класса G у больных с различными формами склероатрофических поражений кожи Вид склероатрофических Группы антигенов, выявляемые поражений кожи в иммуночипе Бляшечная склеродермия p100, VlsE, p58, p41, р39, (n = 22) OspC, p17 Атрофодермия Пазини— p100, VlsE, p58, OspС Пьерини (n = 4) Склероатрофический p58, p41, р39 лихен (n = 3) Хронический атрофиче- p100, VlsE, p58, p41, р39, ский акродерматит (n = 6) ВВК, OspC, p17 Примечание. В скобках — количество серопозитивных больных. 34 № 2, 2012 обследование больных с указанной патологией для получения более точных результатов. Однако обращает внимание присутствие во всех группах обследованных больных антигена р58, который может быть маркером поражения кожи при ИКБ. Таким образом, тест-система в формате иммуночипа обладает высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет выявить широкий спектр антител классов M и G к антигенам боррелий B. afzelii и B. garinii, которые наиболее часто являются этиологическими агентами поражений кожи при ИКБ. Следует отметить, что с помощью данной тест-системы удалось подтвердить боррелиозную этиологию процесса у 15% больных с различными склероатрофическими поражениями кожи. Не вызывает сомнения, что пациентов, страдающих указанной патологией, необходимо выделять в отдельную группу, поскольку они нуждаются в специфической антибактериальной терапии и последующем динамическом наблюдении.

About the authors

V. A Molochkov

T. A Chekanova

M. L Markelov

L. S Karan

E. S Snarskaya

A. S Romashkina

Email: RomashkinaAS@mail.ru

References

Supplementary files