CHANGES IN THE ACTIVITIES OF ANTIOXIDANT ENZYMES UNDER THE EFFECT OF MATRIX METALLOPROTEINASE 9 INHIBITOR IN SKIN MELANOMA BIOMODEL

Full Text

Активные формы кислорода играют важную роль кожи, в частности фотодерматозов, а также злокав активации сигнальных механизмов, регулирую- чественных новообразований кожи. Меланома кожи щих пролиферацию и жизнеспособность клеток, что является одной из наиболее злокачественных опухоимеет значение в развитии некоторых заболеваний лей, диагностика и лечение которой были и остаются Сведения об авторах Белоногов Р.Н. — канд. биол. наук, ассистент (ro-x@yandex.ru); Аксененко М.Б. — аспирант; Рукша Т.Г. — д-р мед. наук. 55 РОССИЙСКИЙ ЖУРНАЛ КОЖНЫХ И ВЕНЕРИЧЕСКИХ БОЛЕЗНЕЙ §1 0 ш л ю 1 3 i I < ^ 20000 η 18 ООО -16 ООО -1400012 ООО -10 ООО -80006000400020000р< 0,05 Γ^Ί 1 3 (D п - СО ■ ! §Ъ I1 < 2 ^ * 2 з.о-j 2.5 -2,0 - 1.5 -1,0 0,50 16000 _ 14000 § S 12000 J vg 10000 l-ι _ 6000- 8000 I « ш а> s d I & 4000 2000 1 Рис. 1 1 Рис. 2 1 Рис.З Рис.4 Рис. 1. Изменение активности СОД (в усл. ед. на 1 г белка) в ткани опухолевого узла меланомы после применения ингибитора ма-триксной металлопротеиназы-9. Здесь и на рис. 2—4: Рис. 2. Изменение активности каталазы (в мкмоль х 104/мин на 1 г белка) в ткани опухолевого узла меланомы после применения ингибитора матриксной металлопротеиназы-9. Рис. 3. Изменение активности СОД (в усл. ед. на 1 г белка) в метастазах печени после применения ингибитора матриксной металло-протеиназы-9. Рис. 4. Изменение активности каталазы (в мкмоль х 104/мин на 1 г белка) в метастазах печени после применения ингибитора матрикс-ной металлопротеиназы-9. сложной проблемой дерматоонкологии [4, 6]. Существенную роль в развитии меланомы кожи играет повышение активности матриксных металлопротеиназ (ММП), которые являются ферментами класса Zn2+ и Ca2+ зависимых эндопептидаз, участвующих в ремоделировании внеклеточного матрикса [5]. Ферменты данной группы принимают активное участие в таких процессах, как опухолевая инвазия и метастазирова-ние, что доказано in vitro и in vivo. Кроме того, известно, что ММП задействованы в регуляции клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза [5]. Данные процессы, в свою очередь, также регулируются активными формами кислорода, образующимися в клетке; известно, что супероксид-радикал и перекись водорода в низкой концентрации стимулируют пролиферацию, а в высокой могут приводить к ее подавлению и служить индукторами апоптоза [2]. Антиоксидантные ферменты, в частности суперок-сиддисмутаза (СОД) и каталаза, контролируя концентрацию радикалов, могут выступать в качестве регуляторов пролиферации. Таким образом, использование ММП в качестве потенциальной мишени для химиотерапии может сопровождаться изменениями показателей антиоксидантной системы, что необходимо учитывать при дальнейшей разработке этого метода лечения. Целью данного исследования стала оценка изменения активности СОД и каталазы, а также уровня экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) в биомодели меланомы кожи при использовании ингибитора ММП-9. Материалы и методы В эксперименте были использованы мыши, самки линии C57B16 8-недельного возраста, из филиала "Столбовая" Научного центра биомедицинских технологий РАМН. Культура клеток меланомы В16 была получена в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина РАМН (Москва). Их разделили при естественном режиме освещения со свободным доступом к воде и пище. Животные были разделены на две равные группы (контрольную и опытную) случайным образом. Прививку опухоли производили путем подкожного введения 0,5 мл взве си опухолевой ткани в растворе Хенкса (1:10) по стандартным методикам. На 10-е сутки после трансплантации опухоли животным опытной группы начали введение ингибитора MMP-9 I ("Calbiochem") в концентрации 5нМ в количестве 0,3 мл, внутримышечно ежедневно однократно в течение 7 дней. Опухолевый материал и внутренние органы животных забирали в течение 30 мин после гибели животного. В гомогенатах опухолевой ткани и метастазах печени определяли активность СОД и каталазы. Метод определения активности СОД основан на ингибировании реакции автоокисления адреналина в щелочной среде в присутствии СОД вследствие дисмута-ции О2- [3]. Метод определения активности каталазы основан на образовании окрашенного в желтый цвет комплекса неразрушенной в ходе каталазной реакции перекиси водорода с молибдатом аммония [1]. Для определения экспрессии PCNA образцы ткани фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. Срезы толщиной до 5 мкм подвергали иммуногистохимическому окрашиванию по стандартной методике с моноклональными антителами к PCNA (разведение 1:200). Для визуализации использовали систему детекции Ready-to-Use ("Novocastra") и диами-нобензидин ("Novocastra") в качестве хромогена. В дальнейшем срезы докрашивали гематоксилином. Подсчет положительно окрашенных клеток производили при 400-кратном увеличении с помощью микроскопа "Olympus BX-41". Оценивали количество положительно окрашенных клеток в метастазах печени в контрольной и опытной группах. Интенсивность иммуногисто-химической реакции изучали по методу гистологического счета H-score по формуле: S = 1а + 2b + 3с, где а — % слабоокрашенных ядер клеток; b — % умеренно окрашенных ядер клеток, с — % сильно окрашенных ядер клеток. Степень выраженности экспрессии ММП-9 расценивали следующим образом: 0—10 баллов — отсутствие экспрессии; 11—100 — слабая экспрессия, 101—200 — умеренная, 201— 300 — выраженная. Для всех данных определяли медиану и интерквартальный разброс в виде подсчета 25 и 75%о. Для оценки достоверности различий между группами использовался критерий Манна— Уитни. Результаты В ходе эксперимента мы получили следующие результаты. В самой опухолевой ткани в группе контрольных животных активность СОД составила 1462 (766; 2671) усл.ед. на 1 г белка, в группе животных, получавших ингибитор ММП-9, — 5414 (1604; 56 № 3, 2012 Рис. 5. Метастатический очаг в печени у животного. Ув. 600. а — контрольная группа; б — опытная группа: отмечается снижение количества PCNA-положительных опухолевых клеток. 18 282) усл.ед. на 1 г белка, таким образом, после применения препарата активность фермента возросла на 270% (рис. 1). Уровень активности каталазы в контрольной группе составил 1,42 (1,08; 2,54) мкмоль х 104/мин х 1 г белка, в опытной группе он возрастает на 7% по сравнению с контролем и равен 1,52 (1,41; 1,63) мкмоль х 104/мин х 1 г белка (рис. 2). В метастазах печени в контрольной группе активность СОД составила 8824 (5615; 14143) усл.ед. на 1 г белка, в опытной группе активность фермента возросла до 9748 (8684; 10412) усл.ед. на 1 г белка, что превышает контрольные показатели на 10% (рис. 3). Уровень активности каталазы в метастазах в печени составил 15,7 (14,1; 25,6) мкмоль х 104/мин х 1 г белка, в опытной группе активность каталазы снизилась на 16% и составила 13,2 (9,8; 17,2) мкмоль х 104/мин х г белка (рис. 4). При оценке процента PCNA-положительных клеток в опухолевом узле меланомы выявили снижение количества PCNA-положительных клеток — с 45 до 20% после ингибирования ММП-9, аналогичную картину наблюдали и в метастазах печени (см. таблицу; рис. 5, а, б). Обсуждение Металлопротеиназы участвуют в процессах канцерогенеза, воздействуя на различные пути передачи сигнала в клетке, основные компоненты внеклеточного матрикса, межклеточные взаимодействия, а также продуцируя различные активные молекулы [5]. Полученные нами результаты свидетельствуют о повышении активности ключевых ферментов анти-оксидантной системы СОД и каталазы в опухолевой ткани меланомы Bl6 у мышей после применения ингибитора ММП-9 по сравнению с таковой у мышей контрольной группы. Тем не менее активность СОД возрастает в значительно большей степени, чем активность каталазы, что может приводить к избыточ- Экспрессия PCNA после применения ингибитора ММП-9 в ткани опухолевого узла и метастазах печени меланомы B16, иммуногистохимический коэфициент [медиана ^25^75)]. Группа животных Показатель контрольная (n = 10) опытная (n = 10) Экспрессия PCNA в тканях опухолевого узла 295 (273;300) 184 (166;197)* Экспрессия PCNA в 265 (169;298) 132 (96;142)* метастазах печени Примечание. * — p < 0,05 — статистическая значимость различий по отношению к показателям в контрольной группе. ному образованию пероксида водорода, способного оказывать токсическое воздействие на клетки опухоли. Изменение активности изучаемых ферментов может быть связано с тем, что ММП-9 принимает участие в регуляции процессов клеточной пролиферации, дифференцировки, которые тесно взаимосвязаны с редокс-состоянием клетки, регулируемым антиоксидантной системой. Для косвенной оценки уровня интенсивности клеточной пролиферации опухоли определяли содержание ядерного антигена пролиферирующих клеток PCNA, максимальный уровень которого наблюдается во время S-фазы клеточного цикла, во время других стадий клеточного цикла концентрация PCNA почти не определяется. В результате проведенного исследования обнаружили значительное снижение количества клеток, экспрессирующих данный белок после ингибирования ММП-9. Таким образом, можно сказать, что одним из механизмов противоопухолевого эффекта ингибитора ММП-9 является изменение редокс-статуса клеток опухоли, что приводит к избыточному образованию активных форм кислорода, способных подавлять пролиферацию и индуцировать апоптоз клеток меланомы [2].

About the authors

R. N Belonogov

Email: ro-x@yandex.ru

M. B Aksenenko

T. G Ruksha

References

Supplementary files