CHANGES IN THE ACTIVITIES OF ANTIOXIDANT ENZYMES UNDER THE EFFECT OF MATRIX METALLOPROTEINASE 9 INHIBITOR IN SKIN MELANOMA BIOMODEL

Abstract


Studies on skin melanoma biomodel showed that matrix metalloproteinase-9 inhibitor caused a much greater increase of superoxide dismutase activity than of catalase activity. This led to excessive formation of hydrogen peroxide, suppressing proliferation when in high concentrations. These events were paralleled by reduction of the number of tumor cells expressing the proliferating cell nuclear antigen.

Full Text

Активные формы кислорода играют важную роль кожи, в частности фотодерматозов, а также злокав активации сигнальных механизмов, регулирую- чественных новообразований кожи. Меланома кожи щих пролиферацию и жизнеспособность клеток, что является одной из наиболее злокачественных опухоимеет значение в развитии некоторых заболеваний лей, диагностика и лечение которой были и остаются Сведения об авторах Белоногов Р.Н. — канд. биол. наук, ассистент (ro-x@yandex.ru); Аксененко М.Б. — аспирант; Рукша Т.Г. — д-р мед. наук. 55 РОССИЙСКИЙ ЖУРНАЛ КОЖНЫХ И ВЕНЕРИЧЕСКИХ БОЛЕЗНЕЙ §1 0 ш л ю 1 3 i I < ^ 20000 η 18 ООО -16 ООО -1400012 ООО -10 ООО -80006000400020000р< 0,05 Γ^Ί 1 3 (D п - СО ■ ! §Ъ I1 < 2 ^ * 2 з.о-j 2.5 -2,0 - 1.5 -1,0 0,50 16000 _ 14000 § S 12000 J vg 10000 l-ι _ 6000- 8000 I « ш а> s d I & 4000 2000 1 Рис. 1 1 Рис. 2 1 Рис.З Рис.4 Рис. 1. Изменение активности СОД (в усл. ед. на 1 г белка) в ткани опухолевого узла меланомы после применения ингибитора ма-триксной металлопротеиназы-9. Здесь и на рис. 2—4: Рис. 2. Изменение активности каталазы (в мкмоль х 104/мин на 1 г белка) в ткани опухолевого узла меланомы после применения ингибитора матриксной металлопротеиназы-9. Рис. 3. Изменение активности СОД (в усл. ед. на 1 г белка) в метастазах печени после применения ингибитора матриксной металло-протеиназы-9. Рис. 4. Изменение активности каталазы (в мкмоль х 104/мин на 1 г белка) в метастазах печени после применения ингибитора матрикс-ной металлопротеиназы-9. сложной проблемой дерматоонкологии [4, 6]. Существенную роль в развитии меланомы кожи играет повышение активности матриксных металлопротеиназ (ММП), которые являются ферментами класса Zn2+ и Ca2+ зависимых эндопептидаз, участвующих в ремоделировании внеклеточного матрикса [5]. Ферменты данной группы принимают активное участие в таких процессах, как опухолевая инвазия и метастазирова-ние, что доказано in vitro и in vivo. Кроме того, известно, что ММП задействованы в регуляции клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза [5]. Данные процессы, в свою очередь, также регулируются активными формами кислорода, образующимися в клетке; известно, что супероксид-радикал и перекись водорода в низкой концентрации стимулируют пролиферацию, а в высокой могут приводить к ее подавлению и служить индукторами апоптоза [2]. Антиоксидантные ферменты, в частности суперок-сиддисмутаза (СОД) и каталаза, контролируя концентрацию радикалов, могут выступать в качестве регуляторов пролиферации. Таким образом, использование ММП в качестве потенциальной мишени для химиотерапии может сопровождаться изменениями показателей антиоксидантной системы, что необходимо учитывать при дальнейшей разработке этого метода лечения. Целью данного исследования стала оценка изменения активности СОД и каталазы, а также уровня экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) в биомодели меланомы кожи при использовании ингибитора ММП-9. Материалы и методы В эксперименте были использованы мыши, самки линии C57B16 8-недельного возраста, из филиала "Столбовая" Научного центра биомедицинских технологий РАМН. Культура клеток меланомы В16 была получена в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина РАМН (Москва). Их разделили при естественном режиме освещения со свободным доступом к воде и пище. Животные были разделены на две равные группы (контрольную и опытную) случайным образом. Прививку опухоли производили путем подкожного введения 0,5 мл взве си опухолевой ткани в растворе Хенкса (1:10) по стандартным методикам. На 10-е сутки после трансплантации опухоли животным опытной группы начали введение ингибитора MMP-9 I ("Calbiochem") в концентрации 5нМ в количестве 0,3 мл, внутримышечно ежедневно однократно в течение 7 дней. Опухолевый материал и внутренние органы животных забирали в течение 30 мин после гибели животного. В гомогенатах опухолевой ткани и метастазах печени определяли активность СОД и каталазы. Метод определения активности СОД основан на ингибировании реакции автоокисления адреналина в щелочной среде в присутствии СОД вследствие дисмута-ции О2- [3]. Метод определения активности каталазы основан на образовании окрашенного в желтый цвет комплекса неразрушенной в ходе каталазной реакции перекиси водорода с молибдатом аммония [1]. Для определения экспрессии PCNA образцы ткани фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. Срезы толщиной до 5 мкм подвергали иммуногистохимическому окрашиванию по стандартной методике с моноклональными антителами к PCNA (разведение 1:200). Для визуализации использовали систему детекции Ready-to-Use ("Novocastra") и диами-нобензидин ("Novocastra") в качестве хромогена. В дальнейшем срезы докрашивали гематоксилином. Подсчет положительно окрашенных клеток производили при 400-кратном увеличении с помощью микроскопа "Olympus BX-41". Оценивали количество положительно окрашенных клеток в метастазах печени в контрольной и опытной группах. Интенсивность иммуногисто-химической реакции изучали по методу гистологического счета H-score по формуле: S = 1а + 2b + 3с, где а — % слабоокрашенных ядер клеток; b — % умеренно окрашенных ядер клеток, с — % сильно окрашенных ядер клеток. Степень выраженности экспрессии ММП-9 расценивали следующим образом: 0—10 баллов — отсутствие экспрессии; 11—100 — слабая экспрессия, 101—200 — умеренная, 201— 300 — выраженная. Для всех данных определяли медиану и интерквартальный разброс в виде подсчета 25 и 75%о. Для оценки достоверности различий между группами использовался критерий Манна— Уитни. Результаты В ходе эксперимента мы получили следующие результаты. В самой опухолевой ткани в группе контрольных животных активность СОД составила 1462 (766; 2671) усл.ед. на 1 г белка, в группе животных, получавших ингибитор ММП-9, — 5414 (1604; 56 № 3, 2012 Рис. 5. Метастатический очаг в печени у животного. Ув. 600. а — контрольная группа; б — опытная группа: отмечается снижение количества PCNA-положительных опухолевых клеток. 18 282) усл.ед. на 1 г белка, таким образом, после применения препарата активность фермента возросла на 270% (рис. 1). Уровень активности каталазы в контрольной группе составил 1,42 (1,08; 2,54) мкмоль х 104/мин х 1 г белка, в опытной группе он возрастает на 7% по сравнению с контролем и равен 1,52 (1,41; 1,63) мкмоль х 104/мин х 1 г белка (рис. 2). В метастазах печени в контрольной группе активность СОД составила 8824 (5615; 14143) усл.ед. на 1 г белка, в опытной группе активность фермента возросла до 9748 (8684; 10412) усл.ед. на 1 г белка, что превышает контрольные показатели на 10% (рис. 3). Уровень активности каталазы в метастазах в печени составил 15,7 (14,1; 25,6) мкмоль х 104/мин х 1 г белка, в опытной группе активность каталазы снизилась на 16% и составила 13,2 (9,8; 17,2) мкмоль х 104/мин х г белка (рис. 4). При оценке процента PCNA-положительных клеток в опухолевом узле меланомы выявили снижение количества PCNA-положительных клеток — с 45 до 20% после ингибирования ММП-9, аналогичную картину наблюдали и в метастазах печени (см. таблицу; рис. 5, а, б). Обсуждение Металлопротеиназы участвуют в процессах канцерогенеза, воздействуя на различные пути передачи сигнала в клетке, основные компоненты внеклеточного матрикса, межклеточные взаимодействия, а также продуцируя различные активные молекулы [5]. Полученные нами результаты свидетельствуют о повышении активности ключевых ферментов анти-оксидантной системы СОД и каталазы в опухолевой ткани меланомы Bl6 у мышей после применения ингибитора ММП-9 по сравнению с таковой у мышей контрольной группы. Тем не менее активность СОД возрастает в значительно большей степени, чем активность каталазы, что может приводить к избыточ- Экспрессия PCNA после применения ингибитора ММП-9 в ткани опухолевого узла и метастазах печени меланомы B16, иммуногистохимический коэфициент [медиана ^25^75)]. Группа животных Показатель контрольная (n = 10) опытная (n = 10) Экспрессия PCNA в тканях опухолевого узла 295 (273;300) 184 (166;197)* Экспрессия PCNA в 265 (169;298) 132 (96;142)* метастазах печени Примечание. * — p < 0,05 — статистическая значимость различий по отношению к показателям в контрольной группе. ному образованию пероксида водорода, способного оказывать токсическое воздействие на клетки опухоли. Изменение активности изучаемых ферментов может быть связано с тем, что ММП-9 принимает участие в регуляции процессов клеточной пролиферации, дифференцировки, которые тесно взаимосвязаны с редокс-состоянием клетки, регулируемым антиоксидантной системой. Для косвенной оценки уровня интенсивности клеточной пролиферации опухоли определяли содержание ядерного антигена пролиферирующих клеток PCNA, максимальный уровень которого наблюдается во время S-фазы клеточного цикла, во время других стадий клеточного цикла концентрация PCNA почти не определяется. В результате проведенного исследования обнаружили значительное снижение количества клеток, экспрессирующих данный белок после ингибирования ММП-9. Таким образом, можно сказать, что одним из механизмов противоопухолевого эффекта ингибитора ММП-9 является изменение редокс-статуса клеток опухоли, что приводит к избыточному образованию активных форм кислорода, способных подавлять пролиферацию и индуцировать апоптоз клеток меланомы [2].

References

  1. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г. //Лабораторное дело. — 1988. — № 1. — С. 16—17.
  2. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.3. и др. — Новосибирск: АРТА; 2008.
  3. Сирота Т.В. // Вопр. мед. химии. — 1999. — Т. 45, вып. 3. — С. 263—272.
  4. Шайн А.А. Онкология. — Тюмень: Академия; 2004. — Т. 4.
  5. Yoon S.-O., Park S.-J., Yun C.-H., Chung A.-S. // J. Biochem. Mol. Biol. — 2003. — Vol. 36, N 1. — P. 128—137.
  6. Zaidi R., Day C.-P., Merlino G. // J. Invest. Dermatol. — 2008. — Vol. 128. — P. 2381-2391.

Statistics

Views

Abstract - 21

PDF (Russian) - 1

Cited-By


Article Metrics

Metrics Loading ...

PlumX

Dimensions


Copyright (c) 2012 Belonogov R.N., Aksenenko M.B., Ruksha T.G.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies