Translation cellular immunotherapy of idiopathic and immunosuppressive Kaposi's sarcoma

Full Text

Саркома Капоши (СК) - мультицентричный неопластический процесс, развивающийся из эндотелия кровеносных и лимфатических сосудов, главным образом дермы. Последние годы характеризуются большими успехами в решении вопроса этиопатогенеза СК: практически доказана роль вируса герпеса человека 8-го типа (HHV-8) как этиологического агента заболевания, описаны некоторые гены этого вируса, обладающие онкогенным потенциалом [1]. По своим морфологическим характеристикам HHV-8 является типичным представителем подсемейства у-герпес-вирусов с размером вирусных частиц примерно 110 нм [2]. Они имеют электронно-плотное ядро и окружены липидной оболочкой. Нуклеокапсиды с оптически плотным ядром обнаруживают в ядрах инфицированных лимфомных клеток, в то время как зрелые, содержащие оболочку вирионы размером 140 нм - в их цитоплазме [3]. Подобные частицы присутствуют и в биоптатах опухолей у больных СК, где они локализуются в единичных веретенообразных клетках, представляющих собой опухолевые клетки эндотелиального происхождения. В последние годы важную роль в развитии СК отводят системе цитокинов [1]. В частности, показана ведущая роль цитокинов в регуляции межклеточных взаимодействий как в норме, так и при различных патологических процессах, таких как инфекционновоспалительные, аутоиммунные, аллергические реакции, в том числе и в генезе опухолей. Универсальность действия цитокинов связана с полипептидной природой и участием в формировании регуляторных сигналов для клеток-мишеней при взаимодействии на организм различных факторов, в том числе и на кожу. Процесс обычно начинается с активации цито-кинов первой линии реагирования - интерлейкина 1 (ИЛ-1), фактора некроза опухоли а (ФНОа), интер-феронов (ИФН), которые в дальнейшем стимулируют каскад других цитокиновых реакций [4]. Важная роль иммунных нарушений в развитии СК позволяет рассматривать состояние иммунного статуса в качестве основного прогностического фактора течения этого заболевания. С учетом этого сегодня на первый план в терапии СК выдвигаются иммунотропные методы, при этом целью проводимого лечения должно быть не только достижение клинического эффекта, но и восстановление иммунорегуляторных механизмов, ответственных за осуществление противоопухолевого надзора. Материалы и методы Под нашим наблюдением находилось 15 больных идио-патическим типом СК и 5 - иммуносупрессивным. Из 15 больных (12 мужчин и 3 женщины) в возрасте от 32 до 75 лет (средний возраст 59 лет) идиопатическим типом СК, у 14 продолжительность заболевания от 4 до 16 лет (в среднем 10 лет), у 1 - 30 лет. У 5 была подострая форма заболевания, у 10 - хроническая. У 5 (33%) больных процесс носил ограниченный характер, у 10 (67%) - распространенный (у 3 с вовлечением слизистых оболочек). У 3 (20%) патологический процесс представлен пятнами размером 2-10 см в диаметре, с четкими границами, разнообразных очертаний с гладкой поверхностью цветом от красноватосинюшного до темно-бурого; у 7(47%) - пятнами, узелками и бляшками. Папулы имели диаметр 0,5-1 см, четкие границы, округлые очертания, полушаровидную или уплощенную форму, плотноэластическую консистенцию, их цвет варьировал от розового до красновато-синюшного или бурого. Местами папулы сливались в бляшки величиной от 1,5-2 до 5-7 см плотноэластической консистенции красно-бурого или темно-вишневого цвета. У 5(33%) больных на фоне пятнистых и инфильтративных элементов имелись опухолевые узлы диаметром от 2 до 5 см, плотной или плотноэластической консистенции, буровато-красного или черно-синюшного цвета, которые располагались изолированно или сливались в бугристые образования. Изъязвление узлов наблюдали у 2 больных, у каждого в области нижних конечностей. В результате распада формировались язвы размером 0,5-4 см с резко очерченными краями, кровянистогангренозным дном синюшно-багрового цвета. В области язв отмечали болезненность. У 7(47%) больных выявлены признаки лимфостаза стоп и/или голеней. Из 5 больных (3 мужчин и 2 женщины) в возрасте от 47 до 70 лет (средний возраст 57 лет) с продолжительностью заболевания от 2 мес до 5 лет с иммуносупрессивным типом СК у 4 болезнь развилась на фоне приема системных кортикостероидных гормонов по поводу бронхиальной астмы (n = 2), ревматоидного полиартрита (n = 2); у 1 - на фоне иммуносупрессивной терапии после трансплантации почки. У 2(40%) больных процесс носил ограниченный характер, у 3(60%) - распространенный (у 2 с вовлечением слизи 14 № 3, 2013 стых оболочек). У 2(40%) пациентов патологический процесс представлен папулами диаметром 0,8-1 см, с четкими границами, округлых очертаний полушаровидной формы, плотноэластической консистенции, цветом от красновато-синюшного до бурого. У 3(60%) папулезные элементы сочетались с инфильтрированными пятнами размером 2,5-5 см в диаметре, с четкими границами, гладкой поверхностью, цветом от красновато-синюшного до темно-бурого. Методика трансляционной клеточной иммунотерапии (ТКИ) заключалась в следующем: за 1,5-2 ч до процедуры больной принимал фотосенсибилизатор аммифурин в дозе 0,6 мг на 1 кг массы тела. Затем больные подвергались процедуре выделения мононуклеарных клеток в прерывисто-поточном режиме на клеточном сепараторе Haemonetics MCS+ по протоколу выделения мононуклеарных клеток. Клетки выделяли из 2000 мл крови (в среднем 6,2 ± 0,8 • 109 клеток в 100 мл плазмы). Добавляли 100 мл физиологического раствора NaCl. Гематокрит составлял не более 2%. Клеточную суспензию подвергали облучению УФ-светом А (X 320-400 нм) на облучателе крови "Юлия" согласно прилагаемой инструкции со скоростью 10-15 мл/мин из одного полимерного контейнера в другой. Общее время облучения 90 мин. После облучения в клеточную суспензию добавляли 200 мл питательного буферного раствора Intersol ("Baxter", США), который предназначен для длительного хранения тромбоцитов (до 7 сут). При постоянном перемешивании в тромбомик-сере выдерживали в течение 18-20 ч при температуре 37оС. По истечении этого срока клеточную взвесь реинфузировали больному в течение 30 мин. Курс лечения состоял из 4 процедур, проводимых 2 раза в неделю [5]. Иммунологический статус исследовали в день проведения процедуры и через 3-4 дня после завершения курса лечения. В качестве контрольной группы (референсные значения) использовали данные, полученные в результате обследования 20 практически здоровых людей - доноров крови, любезно предоставленные сотрудниками лабораторного отдела Московского городского центра ВИЧ-инфекций (руководитель - А.Я. Ольшанский). Иммунофенотипические исследования проводили методом проточной цитометрии с использованием проточных цитометров Cytomics FC 500 ("Beckman Coulter", США) и XL-MCL ("Epics", США). Предподготовку осуществляли на автоматической станции TQ-prep. Общий анализ крови проводили на гематологическом анализаторе Sysmex ICX-21. Проводили 5-параметровый проточно-цитофлюориме-трический субпопуляционный анализ поверхностных антигенов с помощью коммерческих моноклональных антител ("Beckman Coulter", США) конъюгированных FITC, PE, ECD, PC5 и PC7. В качестве контроля применяли коммерческие сыворотки, содержащие изотипические антимышинные Ig, конъюгированные соответствующим флюорохромом. Изучали содержание следующих поверхностных антигенов: CD3 - пан-Т-клетки, CD4 - общую популяцию хелперов;CD8 - цитолитические Т-лимфоциты; CD16 -естественные киллеры; CD20 - общую популяцию В-лимфоцитов; CD14 - моноциты; CD38 - активированные лимфоциты, лимфоплазмоциты; HLA-DR молекулу 2-го класса главного комплекса гистосовместимости (ГКГ); CD25 - рецептор к ИЛ-2; CD83 - маркер дендритных клеток (ДК); CD86- молекулу коактивации на ДК. Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методикам с помощью программы Statistica v.6.0. Эффективность оценивали на основании изменения клинической картины заболевания в динамике, продолжительности периода ремиссии, изменения линейных иммунологических маркеров, молекул активации и коактивации. Результаты и обсуждение При изучении иммунологического фенотипа у больных СК установили изменения, касающиеся Иммунологические показатели у больных саркомой Капоши до и после лечения Кластер диффе-ренцировки, % Референсное значения Больные до ТКИ Больные после ТКИ CD3 72,2 ± 4,4 64,6 ± 12,2 65,8 ± 9,7 CD4 46,6 ± 7,1 37,3 ± 12,2 37,4 ± 7,9 CD8 23,3 ± 5,2 31,5 ± 8,8 32,6 ± 7,9 CD4/CD8 2,12 ± 0,76 1,3 ± 0,7 1,21 ± 0,69 CD16 13,5 ± 3,1 23,6 ± 9,6 23,9 ± 8,3 CD14+CD86+ 17,8 ± 4,19 13,6 ± 5,8 49,4 ± 18,8 CD14+CD83+ 1,2 ± 0,3 58 ± 22,1 20,2 ± 8,3 CD20 7,2 ± 0,6 6 ± 2,6 5,9 ± 1,8 HLA-DR 9,8 ± 0,5 15,5 ± 4,4 13,9 ± 4,3 CD38 30,6 ± 1,5 48,7 ± 16,9 47,1 ± 14,0 CD25 4,2 ± 0,2 15,6 ± 10,2 10,2 ± 5,3 преимущественно клеточного звена иммунной системы (см. таблицу). Количество естественных киллерных лимфоцитов (CD 16+) у больных СК существенно превышало референсные значения (23,6 ± 9,6%; норма 13,5 ± 3,1%; p < 0,05), что свидетельствовало о функциональной активности механизмов системы врожденного иммунного ответа для распознавания патогенассоциированых молекулярных паттернов (структуры), HHV-8 Toll-подобными рецепторами естественных киллерных клеток. В свою очередь и в системе адоптивного иммунного ответа также выявили изменения, касающиеся, c одной стороны, увеличения относительного количества цитолитических Т-лимфоцитов (31,5 ± 8,8%; норма 23,3 ± 5,2%;p < 0,05), с другой - уменьшения относительного количества хелперной субпопуляции (37,3 ± 12,2%; норма 46,6 ± 7,1%; p < 0,05). В результате этого происходило существенное снижение имму-норегуляторного индекса - ИРИ (CD4/CD8 1,3 ± 0,7; норма 2,12 ± 0,76; p < 0,05). Снижение ИРИ может свидетельствовать о наличии иммунодефицитного состояния у больных с наличием выраженного им-муновоспалительного процесса, который сопровождается повышением продукции клетками провос-палительных цито- и хемокинов. Полученные данные служат доказательством несостоятельности механизмов взаимодействия врожденной неспецифической защиты и адоптивного иммунного ответа направленного на локализацию, киллинг и элиминацию чужеродного агента в виде HHV-8 у больных СК. При изучении фагоцитарной функции моноцитов установили, что количество моноцитов, экспрессирующих маркер, который ассоциирован сДК (CD83), значительно превышало референсные значения (58 ± 22,1%; норма 1,2 ± 0,3%; p < 0,05), что свидетельствует о присутствии в периферической крови у больных СК достаточно большого количества зрелых ДК. Однако коэкспрессия коактивационного антигена CD86+ на этих клетках была статистически 15 РОССИЙСКИЙ ЖУРНАЛ КОЖНЫХ И ВЕНЕРИЧЕСКИХ БОЛЕЗНЕЙ 70 60 50 40 30 20 10 О Box & Whisker Plot 86/14 до vs.86/14 после I X <р <40 J' <р° А* : ±1,96*SE 90-| 807060504030200- Box & Whisker Plot 83/14 до vs.83/14 после X Mean <b- I I ±SE : ±1,96*SE Рис. 1. Сравнительные показатели (в %) экспрессии CD14+CD86+ и CD14+CD83+ у больных СК до (1) и после (2) лечения (M ± m). а - экспрессия CD14+CD86+; б - экспрессия CD14+CD83+. значимо ниже референсных показателей, что в свою очередь служит доказательством их слабой иммуно-генности и неспособности индуцировать противовирусный иммунный ответ. Известно, что ДК - самые эффективные анти-генпрезентирующие клетки (АПК), играющие ключевую роль в индукции и детерминировании типа иммунного ответа [6]. Это обусловлено уникальными свойствами ДК. Наиболее значимое из них способность презентации антигенного эпитопа в ассоциации с молекулой ГКГ для специфического распознавания наивными Т-лимфоцитами. Презентация антигенов при отсутствии адекватного количества костимулиру-ющих молекул приводит к формированию анергии -антигенспецифической толерантности [7]. Известно, что HHV-8 при СК поражает и реплицируется в захвативших его ДК. Вирусные пептиды угнетают экспрессию костимуляторных молекул на макрофагах и ингибируют созревание ДК. В результате вместо развития эффективного иммунного ответа имеется негативный исход Т-клеточной активации в виде индукции анергии и апоптоза реактивных Т-клеток. Кроме того, хорошо известно, что активированные ДК продукцируют цитокины, необходимые для активации хелперных Т-лимфоцитов, включая ИЛ-12, который увеличивает иммунологический ответ за счет направления Т-клеток по пути дифференцировки их в Т-хелперы 1-го типа (Th1). При этом стимулированные макрофагами нормальные киллеры секретируют ИФН-у. Два этих цитокина при совместном действии на наивные Т-клетки определяют их развитие в сторону образования CD4 Т-клеток воспаления (Th1). Увеличение синтеза CD25 (15,6 ± 10,2%; норма 4,2 ± 0,2%; p < 0,05), подтверждает предположение о том, что данная патология сопровождается смещением цитокинового профиля в сторону увеличения выработки провоспалительных цитокинов Th1. Полученные данные не противоречат и результатам исследования других авторов [8]. В результате проведения курса ТКИ у всех больных отметили выраженное клиническое улучшение. У пациентов с идиопатическим типом СК произошло снижение интенсивности окраски большинства очагов поражения; папулезные элементы размером от 0,5 до 0,7 см в диаметре регрессировали с исходом в гиперпигментацию, размером от 0,8 до 1,0 см в диаметре уменьшились до 0,3-0,5 см, стали площе; опухолевые узлы уменьшились в 1,5 раза; произошло рубцевание язв; явления лимфостаза разрешились. У пациентов с иммуно-супрессивным типом СК уменьшилась инфильтрация пятнистых элементов, на месте большинства из них осталась гиперпигментация; папулы уплостились, большинство из них уменьшилось в диаметре, некоторые регрессировали полностью. Переносимость такого лечения у каждого больного была удовлетворительной, побочных эффектов не наблюдали. В сроки наблюдения от 1 года до 5 лет период ремиссии заболевания составил от 5 мес до 4 лет (в среднем 14,8 мес). При повторном проведении иммунофенотипиче-ского обследования больных СК после завершения курса ТКИ отметили изменения (рис. 1), которые касались в основном уменьшения относительного ко -личества нефункциональных (слабоиммуногенных) ДК, имеющих фенотип СБ14+СВ83+СБ86- (с58 ± 22,1 до 20,2 ± 8,3%; p < 0,05), и увеличения присутствия на этих клетках коактивационной молекулы CD86, обеспечивающей второй сигнальный путь активации Т-клеточного рецептора (с 13,6 ± 5,8 до 49,4 ± 18,8%; p < 0,05). Это наблюдение свидетельствует о том, что в процессе ТКИ нефункциональные ДК, нафаршированные вирусными эпитопами, обладают и наименьшей жизнеспособностью, в первую очередь склонны к индукции механизмов апоптоза под воздействием внешних провоцирующих факторов, особенно таких, как активированные под воздействием УФА-света молекул 8-метоксипсоралена. В результате апоптоза накапливается большое количество везикул, содержащих антигенные (вирусные) эпитопы в контексте с молекулами ГКГ, т.е. в иммуногенной форме. Последующий захват этих везикул ранними ДК во время инкубационного периода переводит их в полноценные дендритные АПК с высокой экспрессией молекул коактивации (CD86). Введение таких клеток в сосудистое русло больного способно в дальнейшем индуцировать адекватные процессы иммунологической защиты против вирусной репликации. Подтверждением тому служат выраженные положительные изменения клинического состояния больных СК в процессе лечения с применением ТКИ. Отсутствие при этом нормализации линейных антигенов, ассоциированных с основными клеточ- 16 № 3, 2013 ными популяциями, объясняется кон-ституитивным характером, а поэтому определенной инертностью транскрипции матричных РНК для последующей трансляции соответствующего иммунологического рецептора. Приводим клинические примеры эффективности ТКИ при идиопатиче-ском и иммуносупрессивном типах СК. Наблюдение 1 Больной В., 75 лет, поступил 14.05.07 в отделение дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского с жалобами на высыпания в области нижних конечностей, сопровождающиеся болью. Болен с мая 2003 г., когда впервые заметил симметрично расположенные пятна темно-фиолетового цвета на коже стоп и задней поверхности правого бедра. В январе 2005 г. госпитализирован в отделение дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, где провели гистологическое исследование очага поражения в области бедра. Гистологически -старый пятнистый элемент СК. По этому поводу получал следующее лечение: про-спидин внутримышечнопо 0,1 г, свечи виферон ректально по 3 000 000 МЕ 2 раза в день (на курс 60 000 000 Ме); наружно: мазь элоком и компрессы с 30% димексидом. На фоне проводимой терапии отметили положительный эффект в виде уменьшения степени окраски элементов. Однако на суммарной дозе проспидина 1,8 г развилась аллергическая реакция, вследствие чего препарат отменили. С того времени 2 раза в год получал иммунокорригирующую терапию вифероном, реафероном. В начале апреля 2007 г. отметил рост узловых элементов на боковой поверхности правого бедра, появилась боль. 14.05.07 поступил в кожную клинику. Локальный статус. Процесс распространенный; в области стоп представлен пятнами синюшно-фиолетового цвета до 4-5 см; на задней поверхности голени, бедра правой нижней конечности - множественными пятнами округлых очертаний, от светло- до темно-коричневого цвета, до 4 см в диаметре; рассеянными папулами до 1 см в диаметре от темно-фиолетового до бурого цвета, с четкими границами, блестящей поверхностью; на заднебоковой поверхности правого бедра очаг, состоящий из 3 сгруппированных узлов диаметром от 1,2 до 1,7 см, средний узел высотой 2 см с геморрагической коркой на поверхности. Узлы имеют четкие границы, округлые очертания, синюшно-фиолетовый цвет, плотно Рис. 2. Больно а - до лечения; б й В. Саркома Капоши, идиопатический тип. - сразу после лечения; в - через 6 мес после лечения. эластическую консистенцию и располагаются на фоне пятна темно-синюшного цвета размером 5*3 см (рис. 2, а). При обследовании общеклинические анализы крови и мочи в пределах нормы. Диагноз: саркома Капоши, идиопатический тип. Провели 4 сеанса ТКИ, наружно - мазь элоком, компрессы с 30% димексидом 2 раза в день. На фоне лечения наступило значительное улучшение: в области бедра один узел разрешился полностью, два узла уплостились до 0,4 см и 0,3 см в диаметре. Пятнистые и папулезные элементы разрешились с исходом в гиперпигментацию (рис. 2, б). Полностью процесс регрессировал в срок до 6 мес (рис. 2, в). Рецидив заболевания отсутствует в течение 4 лет. Наблюдение 2 Больной Ч., 63 года, поступил в отделение дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского 17.12.09 с жалобами на высыпания на коже живота, верхних и нижних конечностей, половом члене. Болен с августа 2003 г. С 2002 г. по поводу бронхиальной астмы получал внутрь кортикостероидные препараты. В 2003 г. появилось темно-розовое образование на II пальце левой ноги. Рис. 3. Больной Ч. Саркома Капоши, иммуносупрессивный тип. а - до лечения; б - сразу после лечения. 17 РОССИЙСКИЙ ЖУРНАЛ КОЖНЫХ И ВЕНЕРИЧЕСКИХ БОЛЕЗНЕЙ После травмы в месте очага поражения возникло кровотечение. Обратился к хирургу по месту жительства, который произвел ампутацию фаланги. При гистологическом исследовании установлен диагноз саркомы Капоши. С 2006 г. на фоне приема кортикостеродиных препаратов высыпания распространились на нижние конечности и туловище, а в январе 2008 г. - на верхние конечности. С 2002 г. по настоящее время пользуется ингаляционными препаратами, содержащими глюкокортикостероидные гормоны. При поступлении общее состояние удовлетворительное, в легких дыхание ослабленное везикулярное, выслушиваются единичные рассеянные сухие свистящие хрипы на выдохе, тоны сердца ясные, ритмичные, частота сердечных сокращений 70 в минуту, артериальное давление 130/80 мм рт. ст., живот при пальпации мягкий, безболезненный во всех отделах, симптом "поколачивания" по поясничной области отрицательный с обеих сторон. При осмотре кожный процесс распространенный, симметричный, локализован на коже туловища, верхних конечностей (кисти, предплечья), нижних конечностей (стопы, голени, бедра), половом члене. Представлен множественными пятнами, бляшками от 0,9*1,2 до 2,1*2,6 см, единичными папулами до 0,7 см в диаметре с четкими границами от темно-бурого до фиолетового цвета, с гладкой поверхностью (рис. 3, а). На боковых поверхностях туловища элементы располагаются по линиям Лангера. На левой нижней конечности в области подколенной ямки узелок диаметром 1 см темно-фиолетового цвета, плотной консистенции. В области полового члена пятна до 0,5 см в диаметре. Лабораторные данные. Анализы на ВИЧ, RW, HBV, HCV отрицательные. Анализы крови клинический и мочи без патологии. В биохимическом анализе крови выявили повышение уровня холестерина до 5,9 ммоль/л (норма 3,3-5,2 ммоль/л); общего белка до 88 г/л (норма 64-83 г/л); альбумина до 47 г/л (норма 38-44 г/л). Общий анализ мочи: кислая; относительная плотность 1015; белка и глюкозы нет. При ультразвуковом исследовании органов брюшной полости обраружили хронический бескаменный холецистит, диффузные изменения поджелудочной железы, мочекаменную болезнь, камень левой почки. Данных о метастазах нет. Диагноз: саркома Капоши, иммуносупрессивный тип. Получил 4 сеанса ТКИ, наружно мазь элоком, компрессы с 30% димексидом. Пятнистые и некоторые папулезные элементы разрешились с исходом в гиперпигментацию, часть папулезных элементов стала площе, снизилась интенсивность окраски (рис. 3, б). В срок наблюдения за 2 года обострения СК не было. Таким образом, результаты новой иммунологической стратегии лечения больных иммуносупрессив-ной и идиопатической формами СК свидетельствуют о том, что ТКИ является эффективным методом лечения благодаря индукции процессов противоопухолевого иммунологического надзора.

About the authors

M. G Kartashova

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research and Clinical Institute

Email: maxa.ka@mail.ru

A. V Kildyushevsky

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research and Clinical Institute

A. V Molochkov

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research and Clinical Institute

V. A Fedulkina

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research and Clinical Institute

References

Supplementary files