Invasive capacity and proliferative activity of cutaneous melanoma and the epigenetic factor

Full Text

Дисрегуляция клеточного цикла и пролиферации клеток является одной из причин развития злокачественных опухолей. Ряд исследователей представили данные о наличии прямой взаимосвязи между экспрессией N-кадгерина и метастатическим потенциалом опухолевых клеток [1]. N-кадгерин, находясь в синергической связи с рецепторами FGF-2 посредством передачи сигналов, способствует увеличению активации и экспрессии матриксных металлопро- теиназ, а следовательно, и опухолевой инвазии [2]. Помимо сигнальной функции N-кадгерина, при ме- тастазировании рассматривается также его функция в поддержании системного распространения опухолевых клеток. Клетки меланомы по мере прогрессии заболевания постепенно теряют способность к экспрессии E-кадгерина, но начинают усиленно экспрессировать N-кадгерин как in vitro, так и in vivo [3]. Данная замена экспрессии позволяет клеткам активно взаимодействовать с микроокружением, тем самым способствуя дальнейшему развитию опухоли. Экспрессия данного белка осуществляется преимущественно фибробластами и эндотелиальными клетками сосудов [4], что обеспечивает N-кадгерин-зависимую адгезию, а также интра- и экстравазацию в кровеносные сосуды клеток меланомы. Экспрессия N-кадгерина позволяет реализовывать опухолям такие важные функции, как опухолевая инвазия, адгезия и миграция клеток. Кроме адгезивных свойств, появление экспрессии N-кадгерина меланомными клетками обеспечивает Рис. 2. Экспрессия N-кадгерина в клетках опухолевой ткани. Рис. 1. Экспрессия N-кадгерина в клетках опухолевой ткани и лимфоцитах. их коммуникацию с соседними клетками опухоли, а также с дермальными фибробластами [5]. Высокая экспрессия N-кадгерина наблюдается при различных видах злокачественных новообразований, в частности в клетках поджелудочной железы, а также в опухолях нейронального генеза [6, 7]. B-Raf - серин/треониновая киназа, которая участвует в Ras-Raf-MEK-МАРК-сигнальном пути [8]. Данный сигнальный каскад в норме регулирует пролиферацию и функционирование клеток под контролем факторов роста и гормонов. По данным литературы [9], Р-катенинсигнальный механизм контролирует процесс метастазирования в BRAF- активированных Pten-дефицитных меланомах, при которых в свою очередь отмечается высокая экспрессия N-кадгерина в эксперименте. Мутация гена BRAF определяется в 40-60% меланом, с превалированием среди опухолей, расположенных на закрытых участках тела. BRAF-позитивные меланомы представляют собой один из молекулярных подтипов меланомы. В связи с этим является важным изучение особенностей течения, биологического поведения меланом с положительным BRAF-статусом. Одним из маркеров клеточной пролиферации является Ki-67. Этот белок появляется в ядре клетки в заключительной части фазы G1 и с высокой интенсивностью экспрессируется до завершения митоза [10]. Прогностическая ценность экспрессии Ki-67 клетками меланомы кожи до сих пор оценивается неоднозначно. По некоторым данным [11], экспрессия Ki-67 не является прогностическим фактором при первичной меланоме. Установлено, что при узловых меланомах уровень пролиферации практически не влияет на прогрессию болезни. В узловой меланоме Ki-67 не связан с толщиной опухоли и не оказывает влияния на отсутствие рецидивов или выживание в целом [12]. Имеются данные, что при меланоме слизистых оболочек низкий уровень экспрессии Ki-67 ассоциирован с лучшими показателями выживаемости [13]. Цель исследования - оценить инвазивную способность и пролиферативную активность опухоли путем иммуногистохимического определения экспрессии N-кадгерина и Ki-67 у больных меланомой кожи в зависимости от наличия у них мутации V600E онкогена BRAF. Материалы и методы Протокол исследования одобрен Локальным этическим комитетом Красноярского государственного медицинского университета. Объектом данного исследования послужили образцы опухолевого материала, полученные из парафиновых блоков от больных меланомой кожи, проходивших лечение в Красноярском краевом онкологическом диспансере. Биоптаты больных меланомой кожи (n = 80) получены в Красноярском краевом патологоанатомическом бюро. Перед выделением ДНК стекла пациентов, окрашенные гематоксилином и эозином, оценивали на предмет содержания опухолевых клеток в срезе. В дальнейшем проводили выделение геномной ДНК с помощью набора FFPET DNA-Extraction Kit (“Биолинк”). Анализ мутации BRAF-V600E осуществляли методом аллельспецифической ПЦР в режиме реального времени. Для BRAF-теста выбирали разведение клинического образца ДНК, имеющее значение Ct, наиболее близкое к отрицательному ДНК-стандарту: оптимальным считается, чтобы Ct неизвестных образцов в контрольной реакции отличалось от Ct ДНК контроля не более чем на 2 цикла. Образец ДНК расценивали как положительный (содержащий мутацию), если dCt образца < dCt положительного контроля, содержащего 5% мутантной ДНК. Образец ДНК считался отрицательным (нет мутации или мутировано менее 1% ДНК-копий гена BRAF), если dCt-образец > dCtm, где Ctm - Ct положительного стандарта (контроля), содержащего 5% ДНК с мутацией BRAF V600E. Далее пациенты были разделены на 2 группы в соответствии с молекулярно-генетическими подтипами опухоли: 1-я группа (n = 33) - пациенты с наличием мутации BRAF V600E, 2-я группа (n = 47) - пациенты без мутации BRAF V600E.Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартной методике. Для определения экспрессии N-кадгерина применяли поликлональные антитела к N-кадгерину (”Abcam”, Великобритания), разведение 1:100. Для определения экспрессии Ki-67 применяли поликлональные антитела к Ki-67 (“Spring Bioscience”, США). В дальнейшем использовали систему детекции Reveal TM Biotin Free System (“Spring Bioscience”, США). В качестве хромогена применяли AEC (“Spring Bioscience”, США). В качестве индикатора пролиферативной активности использовали индекс пролиферации (ИП) Ki-67, который определяли как долю интенсивно окрашенных ядер при учете 300 клеток, выраженную в процентах. Рис. 4. Экспрессия N-кадгерина в клетках дермы. N-кадгеринположительные клетки окрашены красным цветом. Рис. 3. Экспрессия N-кадгерина в клетках опухолевой ткани. N-кадгеринположительные клетки окрашены красным цветом. Для оценки интенсивности иммуногистохимической реакции с N-кадгерином рассчитывали иммуногистохими- ческий индекс, определяемый по формуле: % интенсивно окрашенных клеток (3+) х % умеренно иммуноокрашен- ных клеток (2+) х % слабоокрашенных клеток (1+). Для статистической обработки данных использовали программу Statistica 7,0. Проверку нормальности распределения выборки производили с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Учитывая, что характер распределения в данной выборке не являлся нормальным, использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Для оценки различий качественных признаков применяли точный односторонний критерий Фишера. Прир < 0,05 различия считали статистически значимыми. Результаты и обсуждение Экспрессия N-кадгерина опухолевыми клетками наблюдалась в 39,3% случаев (рис. 1-3). Экспрессия N-кадгерина клетками дермы, в частности фи- бробластами и лимфоцитами, отмечалась в 66,6% случаев (рис. 4-6), причем в 30,3% случаев экспрессия N-кадгерина наблюдалась только в клетках дермы, а опухолевые клетки при этом оставались интактными. Пациенты, у которых наблюдалась экспрессия N-кадгерина опухолевыми клетками, имели в 41,4% случаев положительный BRAF-статус. В 58,6% случаев данная мутация отсутствовала. Пациенты, у которых экспрессия N-кадгерина наблюдалась в клетках здоровой кожи (фибробласты, лимфоциты, кератиноциты), имели в 30% случаев положительный BRAF-статус и в 70% случаев не имели данной мутации. Средний иммуногистохи- мический коэффициент у всех обследованных пациентов с меланомой кожи составил 40,9. При этом иммуногистохимический коэффициент у пациентов с BRAF-позитивным статусом был почти в 2 раза выше (65,6), чем у пациентов с BRAF-негативным статусом (34). При этом статистическая значимость различий между данными группами не установлена (p = 0,19), но тенденция к увеличению показателя экспрессии N-кадгерина у пациентов с наличием мутации BRAF V600E может свидетельствовать об увеличении инвазивной способности опухоли у пациентов, имеющих мутацию BRAF V600E. Средний возраст BRAF-позитивных пациентов составил 51,4 ± 12,73 года, у BRAF-негативных пациентов он был более чем на 10 лет старше и составил 66,3 ± 12,22 года (p = 0,18). На основании исследования данной выборки пациентов можно сделать заключение о том, что экспрессия N-кадгерина не зависит от пола (p = 0,41). В группе BRAF-положительных пациентов с высоким уровнем экспрессии N-кадгерина Рис. 6. Экспрессия N-кадгерина в клетках дермы. На фото представлены N-кадгеринположительные фибробласты, лимфоциты. Рис. 5. Экспрессия N-кадгерина в клетках дермы. N-кадгеринположительные клетки окрашены красным цветом. BRAFV600E ji A> f N-кадгерина \Е-кадгерина -Инвазия опухоли siRNA Braf ► I tRac, Tiam I ► i Г BRAF V600E J I | N-кадгерина f Е-кадгерина > , 4 Инвазия опухс Рис. 7. Регуляция Rac-зависимых кадгеринов мутантным онкогеном BRAF. 2 в 100% случаев имелась узловая форма меланомы, в то время как у BRAF-негативных пациентов присутствовали все клинико-морфологические формы заболевания. При оценке уровня экспрессии Ki-67 установлено, что у пациентов с BRAF-позитивным статусом ИП был в 2 раза выше, чем у пациентов, не имеющих данной мутации. ИП составил 22,2 и 11,1 соответственно (р = 0,11), что говорит об одинаковом характере пролиферативной активности в клетках меланомы независимо от BRAF-статуса. Увеличение экспрессии N-кадгерина у пациентов с наличием мутации в гене BRAF V600E схематически можно объяснить следующим образом (рис. 7). Способность опухолевых клеток к инвазии в ткань дермы является критическим событием в развитии меланомы кожи и в итоге индикатором плохого прогноза для пациентов. Однако молекулярные процессы, связанные с приобретением данного инвазивного фенотипа, требуют дальнейшего разъяснения. Мутация BRAF, как сказано выше, регулирует инвазивный фенотип опухоли. В клетках меланомы, имеющих мутацию BRAF V600E, наблюдается высокий уровень N-кадгерина и низкий уровень Е-кадгерина. Показано, что при воздействии на клетки меланомы малыми интерферирующими РНК (siRNA) происходит снижение уровней N-кадгерина и увеличение уровней Е-кадгерина [14]. Но для осуществления этого переключения необходимы активизация белков Rac1 и Tiam1, которые в свою очередь показывают сниженную активность в присутствии мутантного BRAF. Rac1 является представителем семейства «малых» ГТФаз (семейства ферментов гидролаз, которые связывают и гидролизуют гуанозинтрифос- фат), играет роль в регуляции некоторых процессов, происходящих в клетке, включающих реорганизацию актина цитоскелета, осуществление межклеточной адгезии [15]. Кроме того, известно, что Rac защищает клетки от Ras-индуцированного апоптоза через активацию транскрипционного фактора NF-kB [16]. Ингибирование мутантного BRAF приводит к снижению инвазивной способности клеток. Однако одновременное ингибирование B-RAF и Rac или Tiam1 приводит, наоборот, к усилению инвазивной способности клеток. Отсюда можно сделать вывод, что мутантный сигнал от BRAF подавляет активность Tiam1/Rac, что приводит к увеличению уровня N-кадгерина и снижению уровня E-кадгерина и в конечном счете к повышению инвазивных характеристик опухоли. Таким образом, можно предположить, что при применении препаратов группы BRAF-ингибиторов существует опасность увеличения инвазивных характеристик опухоли на фоне функционально измененных Rac и Tiam1. Известно, что BRAF-ингибиторы дают краткосрочный терапевтический эффект при BRAF-положительных опухолях, что объясняется несколькими причинами, в том числе реактивацией сигнального пути МАРК, активацией иных механизмов передачи сигнала, регулирующих пролиферацию, выживаемость клеток опухоли. BRAF-зависимое переключение экспрессии с N-кадгерина на E-кадгерин является важным, но не единственным звеном в реализации инвазивных характеристик опухоли.

About the authors

M. B Aksenenko

V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: aksenenko_mariya@mail.ru
660022, Krasnoyarsk, Russia

Tatyana G. Ruksha

V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: tatyana_ruksha@mail.ru
MD, PhD 660022, Krasnoyarsk, Russia

References

Supplementary files