Antiproliferative effect of matrix metal-loproteinases 9 and 13 in experimental cutaneous melanoma in vivo

Full Text

Меланома кожи относится к наиболее агрессивно протекающим злокачественным новообразованиям, характеризующимся быстрым развитием метастази-рования. При этом в ряде случаев возникают затруднения в дифференциальной диагностике меланомы кожи и доброкачественных меланоцитарных новообразований, отсутствует эффективная терапия дис семинированных форм меланомы кожи, что обусловливает актуальность дальнейшего изучения аспектов патогенеза и поиск новых молекулярных мишеней для возможного терапевтического воздействия. В последнее время особый интерес в онкологии представляют исследования ферментов протеолити-ческой системы, в частности семейства матриксных Сведения об авторах: Палкина Надежда Владимировна - аспирант (mosmanNV@yandex.ru); Рукша Татьяна Геннадьевна - доктор мед. наук (tatyana_ ruksha@mail.ru). 60 № 2, 2014 металлопротеиназ (ММП) [1]. ММП - это структурно связанные эндопептидазы, функционально связанные с обменом белков межклеточного матрикса [2]. Семейство ММП состоит более чем из 20 ферментов, способных расщеплять почти все компоненты внеклеточного матрикса соединительных тканей [3, 4]. Известно, что ММП играют центральную роль в обмене белков соединительной ткани, в процессах нормального развития и ремоделирования клеточного матрикса, эмбриогенезе, репарации тканей, нео-ангиогенезе, а также в процессах опухолевой трансформации и метастазирования [1, 5, 6]. Есть ряд исследований [7, 8], подтверждающих важную роль ММП в развитии злокачественных новообразований, в частности меланомы кожи. ММП играют важную роль в инвазии и метастазировании меланомы, они участвуют в разрушении компонентов внеклеточного матрикса, например фрагментов коллагена IV типа, обеспечивая подвижность опухолевых клеток. Помимо участия в деградации внеклеточного матрикса, ММП могут влиять на микроокружение опухоли путем высвобождения ростовых факторов и факторов ангиогенеза. Они выполняют важные регуляторные функции, активируя, инактивируя и модифицируя свойства целого ряда биологически активных молекул [9]. При этом не все биологические механизмы и эффекты данных эндопептидаз являются установленными. Особые функции в канцерогенезе выделяют у ММП-9 и ММП-13. ММП-9 (желатиназа В) секретируется как профермент массой 92 кД, ее источниками являются кератиноциты, моноциты, лейкоциты, макрофаги и фибробласты. Субстраты для MM^9 включают денатурированный коллаген I типа (желатин), нативные коллагены IV, V, VII, X и XI типов, фибриноген, витронектин и энтактин, который соединяет ламинин и коллаген IV типа [10]. ММП-9 обеспечивает ангиогенез в опухолевой ткани, тем самым способствуя ее росту [8]. MM^13, также известная как коллагеназа-3, обладает широкой субстратной специфичностью и играет важную роль в инвазии и метастазировании опухолей [1]. Повышенная экспрессия ММП-13 наблюдалась при раке молочной железы и дыхательных путей, опухолях головы и шеи, раке простаты [7, 8]. Кроме того, повышенную активность ММП-13 связывают с агрессивным течением меланомы [8]. Ретроспективный анализ исследований экспрессии ММП у онкологических больных показывает, что повышение экспрессии многих ММП, включая также ММП-9 и ММП-13, в первичной опухоли и/или метастазах позитивно связан с такими характеристиками, как низкая дифференцировка опухолевых клеток, высокая инвазивность, высокая метастатическая активность, неблагоприятный прогноз, сокращение продолжительности жизни [11, 12]. Имеются данные о том, что ММП за счет своих множественных биологических эффектов способны регулировать клеточную пролиферацию в злокачественных новообразованиях [13-16]. Нарушения клеточной пролиферации и прогрессивный рост малигнизированных клеток, индуциро ванный изменениями экспрессии про- и онкогенов, являются одними из ключевых событий в развитии опухолевого заболевания [17]. Помимо этого, клеточная пролиферация играет важную роль в оценке метастатического потенциала и клинического прогноза меланомы кожи. В связи с этим изучение регуляции клеточной пролиферации необходимо для понимания процессов развития и прогрессии онкологических заболеваний, а также для оптимизации методов их терапии [17]. Цель данного исследования - установление биологических эффектов ММП-9 и ММП-13 в отношении роста меланомы кожи in vivo. Материалы и методы Эксперимент проводили на лабораторных мышах линии C57Bl6. Перед проведением экспериментальной работы с животными было получено разрешение локального этического комитета и биоэтической комиссии ГБОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого (№ 44/2012 от 15.11.12). Все исследования проводили в соответствии с требованиями и условиями, изложенными в Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных и приказом Минздрава РФ № 708н от 23.08.10 "Об утверждении правил лабораторной практики". В эксперименте использовали половозрелых самок мышей линии C57Bl6 в возрасте 8-10 нед, массой от 19 до 26 г, с перевитой меланомой B16, которые были разделены на 3 группы -контрольную (п = 5) и две опытные (п = 7 в каждой группе). Животных содержали при естественном режиме освещения со свободным доступом к воде и пище. На 14-й день после трансплантации опухолевых клеток животным опытных групп начинали терапию ингибитором ММП-9 (MMP-9 Inhibitor I, "Calbiochem", США) в различных дозировках - для селективного ингибирования ММП-9 в 1-й опытной группе и неселективного ингибирования ММП-9 и ММП-13 во 2-й опытной группе. Препарат вводили внутримышечно 1 раз в день в течение 7 дней. Для оценки динамики увеличения роста опухолевого узла 1 раз в 3 дня вычисляли объем опухолевого узла с 5-го дня трансплантации меланомы и вплоть до окончания терапии ингибитором путем измерения длины и ширины узла. Приблизительный объем опухоли рассчитывали по формуле: (длина, мм х ширина2, мм)/2. Сравнение динамики объема опухолевого узла в каждой группе по дням проводили с использованием непараметрического дисперсионного анализа Фридмана. При получении p < 0,05 переходили к парным сравнениям для зависимых групп, используя критерий Вилкоксона с поправкой Бонферрони. Межгрупповые сравнения по каждому дню наблюдения проводили с помощью непараметрического дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса, при получении p < 0,05 переходили к многогрупповым сравнениям. Различия между сравниваемыми показателями считали статистически значимыми при p < 0,05. После 7-дневной терапии животных во всех группах выводили из эксперимента путем эвтаназии. При вскрытии животного извлекали опухолевый узел (рис. 1), проводили определение массы и объема узла. Объем узла вычисляли по формуле: длина х ширина х высота (в мм3). При сравнении объемов опухолевых узлов в исследуемых группах использовали непараметрический дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса для трех независимых групп. При получении p < 0,05 переходили к многогрупповым сравнениям. Различия между сравниваемыми показателями считали статистически значимыми приp < 0,05. Постановка зимографии. Часть ткани выделенных опухолевых узлов брали для постановки зимографии желатиназ в полиакриламидном геле (ПААГ) с целью проверки эффективности ингибирования ММП-9. Образцы ткани меланомы В16 из первичного опухолевого узла подвергали гомогенизации, далее из гомогенатов получали супернатанты. В супернатантах опре- 61 РОССИЙСКИЙ ЖУРНАЛ КОЖНЫХ И ВЕНЕРИЧЕСКИХ БОЛЕЗНЕЙ 1400 Рис. 1. Выделенный опухолевый узел меланомы В16. Рис. 2. Иммуногистохимическое окрашивание ткани опухолевого узла на маркер клеточной пролиферации PCNA. Ядра пролиферирующих клеток окрашены в коричневый цвет. Ув. 400. ct 0 1 о> I с -О Б о х ш S Ё < 1200 1000 800 600 400 200 деляли количество белка по методу Бредфорд. Образцы уравнивали по белку. Супернатант наносили в лунку в объеме, содержащем 50 мкг белка, добавляя равное количество буфера для образцов, содержащего 0,125 моль трис-HCl, pH 6,8, 4% (w/v) SDS, 0,01% бромфеноловый синий и 20% глицерол. Электрофорез проводили в 6% ПААГ с 0,1% желатином. После электрофореза SDS вымывали из геля в растворе 2,5% тритон X, погружая гель в раствор на 30 мин, затем раствор меняли на свежий и оставляли еще на 15 мин. Далее гель погружали в раствор инкубационного буфера, содержащий 50 ммоль/л трис-HCl, 0,2 моль/л NaCl, 10 ммоль/л CaCl2, pH 7,5, инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 16 ч. Гель промывали в дистиллированной воде и погружали в раствор, содержащий 0,01% Кумасси G-250, 30% изопропанол, 10% ледяную уксусную кислоту, выдерживали в течение 1 ч, затем гель отмывали в растворе, содержащем 10% метиловый спирт, 5% ледяную уксусную кислоту, в течение нескольких минут, а после - дистиллированной водой. Получали зоны просветления на темном фоне геля - результат протеолитической активности ММП-9. Эффективность протеолиза оценивали с помощью гель-документирующей системы ChemiDoc™ XRS+ ("Bio-Rad Laboratories", США) с программным обеспечением Image Lab™. Окрашенную зимограмму сканировали, на изображении определяли яркость и площадь лизиса. Обработку цифровых данных проводили методом вариационной статистики для двух независимых групп с применением U-теста Манна-Уитни. Различия между сравниваемыми показателями считали статистически значимыми приp < 0,05. Иммуногистохимическое исследование. Выделенный опухолевый узел фиксировали в 10% нейтральном формалине, заклю- ' Медиана Контроль ММП-9 Ц 25-75% “Г Мин.-Макс. Рис. 3. Активность фермента ММП-9 в исследуемых группах по результатам зимографии. чали в парафин и изготавливали гистологические срезы, которые подвергали иммуногистохимическому окрашиванию на маркер клеточной пролиферации - PCNA (Novocastra) с помощью моноклональных антител в разведении 1:200, для визуализации использовали хромоген 3-amino-9-ethylcarbazol (AEC). Уровень экспрессии PCNA определяли путем вычисления процента пролиферирующих клеток, имеющих положительно окрашенные ядра (рис. 2). При сравнении уровней клеточной пролиферации для исследуемых групп использовали непараметрический дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса. При получении p < 0,05 переходили к многогрупповым сравнениям. Различия между сравниваемыми показателями считали статистически значимыми при p < 0,05. Результаты и обсуждение Зимография образцов опухолевой ткани подтвердила эффективность ингибирования ММП в экспериментальных группах. Как видно на рис. 3, активность ММП-9 в группе образцов, в которых активность данного фермента была ингибирована, статистически значимо ниже активности этого фермента в контрольной группе. Контроль ММП-9 ММП-9+ММП-13 Рис. 4. Динамика изменения среднего объема опухоли в исследуемых группах. ММП-9 - p < 0,05 - различия статистически значимы на 8, 11, 14, 17-й день по сравнению с 5-м днем в группе ММП-9; ММП-9 + ММП-13 - p < 0,05 - различия статистически значимы на 8, 11, 14, 17-й день по сравнению с 5-м днем в группе ММП-9 + ММП-13; Контроль -p < 0,05 - различия статистически значимы на 8, 11, 14, 17-й день по сравнению с 5-м днем в группе контроля. 3,5п 3,0 2,5 2,0- L 1,5св . _ о 1,04 о ’ со ^ 1,0 0,0-0,5-1,0 -1,5 А<? & ' Сред. У У * /■ | Сред.±СО Сред.±ДИ Рис. 5. Показатели массы опухолевых узлов в исследуемых группах. 62 № 2, 2014 8000- 7000- 6000- 5000- 4000- s 3000- 2 2 2000- \о о юоо- 0- -1000- -2000- -3000- 4-° ■ Сред. У У * /■ | Сред.±СО Сред.±ДИ < z о Q_ Q. 0 * Q. СО 5 S S о 0 0 Q. С 2 ГО -Q 1 0 Ш О а Сред. | Сред.±СО Сред.±ДИ Рис. 6. Показатели объемов опухолевых узлов в исследуемых группах. Рис. 7. Уровни экспрессии маркера клеточной пролиферации (PCNA) в исследуемых группах. * p < 0,05 - статистически значимо по отношению к группе ММП-9. При измерении объема опухолевых узлов в экспериментальных группах получены статистически значимые различия в изменении объема опухоли по каждому дню наблюдения в каждой группе (р < 0,05). Однако статистически значимых различий в объеме опухоли на каждый день наблюдения при межгруп-повых сравнениях не получено даже после начала терапии ингибитором ММП-9 (рис. 4). Имелась отчетливая тенденция к увеличению объема опухоли в группе животных, получающих терапию ингибитором в дозе, селективно ингибирующей ММП-9. При сравнении исследуемых групп по массе первичного опухолевого узла статистически значимых различий не выявлено (р = 0,49), но также имелась тенденция к увеличению массы первичного опухолевого узла в группе мышей, получавших терапию ингибитором в дозе, селективно ингибирующей ММП-9 (рис. 5). Аналогичные результаты получены при анализе объема опухолевых узлов - статистически значимых различий между группами не выявлено (р = 0,4), но также определялась тенденция к увеличению объема первичного опухолевого узла в группе с ингибированной ММП-9 (рис. 6). Исследуя клеточную пролиферацию, мы анализировали процент пролиферирующих клеток в каждой группе. Статистически значимых различий уровней клеточной пролиферации в опухолевых узлах у мышей, получавших терапию ингибитором ММП, в обеих группах по сравнению с контрольной группой не выявлено. Однако установлено статистически значимое увеличение клеточной пролиферации меланомы в группе мышей, у которых селективно ингибирована ММП-9, по сравнению с группой, в которой ингибированы и ММП-9, и ММП-13 (рис. 7). Предполагалось, что в группах животных, которые получали терапию ингибитором, опухолевый рост и клеточная пролиферация в опухолевых узлах будут заторможены либо будут иметь слабоположительную динамику в отличие от животных, не получавших терапию. Однако полученные результаты свидетельствуют об обратном. При этом в группе животных, получавших селективную терапию ингибитором ММП-9, в отличие от группы, в которой ингибированы ММП-9 и ММП-13, показатели клеточной пролиферации статистически значимо выше, а также наметилась тенденция к увеличению массы и объемов первичных опухолевых узлов. Таким образом, ингибирование ММП-9 и ММП-13 не дает выраженного противоопухолевого эффекта, что может быть связано с активацией в данном случае других металлопротеиназ либо иных молекулярных механизмов, компенсирующих недостаточность эффектов ингибированных ферментов. Поэтому требуется дальнейшее изучение механизмов действия металлопротеиназ при меланоме кожи для оценки возможности использования их ингибиторов в качестве молекулярных терапевтических мишеней.

About the authors

N. V Palkina

VF. Voino-Yasenetsky State Medical University

Email: mosmanNV@yandex.ru

T. G Ruksha

VF. Voino-Yasenetsky State Medical University

Email: tatyana_ruksha@mail.ru

References

Supplementary files