Genodiagnosis of HPV beta DNA association with seborrheic keratosis in immunosuppressed and immunocompetent patients

Abstract


Numerous data indicate the involvement of human papilloma virus (HPV), genus beta, in the development of epithelial tumors of the skin. We studied the association of seborrheic keratosis (SK) with HPV by analysis of HPV beta DNA, including that in immunosuppressed patients. Twenty recipients of renal transplants and 20 immunocompetent patients with SK were examined. Control group consisted of 49 volunteers without epithelial tumors of the skin. Genodiagnosis of HPV beta DNA in biopsy specimens was carried out by the real time polymerase chain reaction with hybridization fluorescent detection. Amplification and detection were carried out on a Rotor-Gene 3000 device (Corbett Research, Australia). The results indicated high levels of HPV DNA in transplant recipients - in foci of SK and in visually intact skin (in 85 and 55% cases, respectively), which was higher than the incidence of the virus in donor skin (47%). Virus charge in SKfoci was significantly higher than in the control group.

Full Text

Эпителиальные опухоли кожи - одна из самых распространенных групп опухолей, отличающаяся значительным разнообразием. Изучение их этиологии и патогенеза представляет значительный интерес для оптимизации лечения и профилактики. Провоцировать развитие эпителиальных опухолей могут интенсивная инсоляция, химические канцерогены, определенную роль отводят наследственным и иммунологическим нарушениям [1]. В настоящее время в связи с достижениями в области молекулярной биологии предпринимаются попытки определения роли вируса папилломы человека (ВПЧ) рода beta в развитии отдельных вариантов эпителиальных опухолей кожи - плоскоклеточного и базально-клеточного рака, актинического кератоза, ке- ратоакантомы, себорейного кератоза (СК) [1-3]. Наличие ВПЧ рода beta в целом ряде эпителиальных опухолей может быть следствием как активной вирусной инфекции, так и независимой бессимптомной персистен- ции, характерной для факторов естественной резистентности [1-3]. Поэтому, помимо выявления ВПЧ рода beta, целесообразно проводить количественное измерение вирусной нагрузки, определение которой является сравнительно новым подходом не только в диагностике папилло- мавирусной инфекции, но и в ее мониторинге, лечении и профилактике [3]. Отсутствие в большинстве очагов транскрипционной активности и низкая вирусная нагрузка, сопоставимая с таковой в здоровой коже, противоречат предположению о роли ВПЧ в стимуляции опухолевого роста [1-3]. Тем не менее ряд популяционных исследований, молекулярные и патоморфологические данные подтверждают, что ВПЧ рода beta могут играть этиологическую роль в развитии эпителиальных опухолей [4-6]. Иммуносупрессия является важным кофактором развития большинства эпителиальных новообразований кожи [6-8]. Так, по данным литературы [3], отмечается, что формирование ВПЧ-ассоциированных бородавок, ороговевающих кожных опухолей, в том числе себорейных кератом и немела- ноцитарных видов рака кожи, значимо повышается после операций трансплантации внутренних органов (рис. 1). Себорейный кератоз (СК) является самой распространенной доброкачественной эпителиальной опухолью кожи неизвестной этиологии, и сегодня ВПЧ рассматривается как один из возможных этиологических факторов. Ассоциация ВПЧ с СК была подтверждена в ряде исследований. Так, было показано наличие ВПЧ рода beta в 42 (76%) из 55 биоптатов СК у реципиентов почечного трансплантата (РПТ) против 13 (27%) из 48 образцов здоровой кожи (p < 0,005) [8]. Наряду с этими результатами в ряде других работ с использованием менее чувствительных разновидностей полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК ВПЧ в СК обнаружить не удалось [9]. С учетом вышеизложенного изучение ассоциаций ВПЧ с различными формами эпителиальных образований кожи (доброкачественными, предраковыми и злокачественными) на основе современных молекулярных методик с целью количественного определения ДНК ВПЧ является актуальной задачей дерматоонкологии, решение которой будет способствовать дальнейшему пониманию взаимосвязей развития эпителиальных образований кожи с ВПЧ. Цель исследования - изучить ассоциацию СК с ВПЧ на основе количественного анализа ДНК ВПЧ. Задачи исследования: определить встречаемость ДНК ВПЧ рода beta в СК и видимо здоровой коже РПТ и иммунокомпе- тентных больных, а также изучить вирусную нагрузку ДНК ВПЧ рода beta в СК и видимо здоровой коже РПТ и иммунокомпетентных людей. Рис. 1. Множественные очаги себорейного кератоза, развившегося у пациентки после трансплантации почки. Материалы и методы Обследовано 60 больных с РПТ, находящихся на лечении в отделении хронического гемодиализа и трансплантации почки, длительно получающих курсы иммуносупрессивной терапии. У 20 пациентов, имеющих множественные элементы СК, был проведен забор материала (микробиоптат кожи) из очагов СК, а также взят образец здоровой кожи в области плеча. Аналогично обследованы 20 иммунокомпетентных больных с множественными проявлениями СК, не получавших иммуносупрессивную терапию. Группа иммуносупрессивных лиц состояла из 10 мужчин и 10 женщин в возрасте от 22 до 60 лет (средний возраст 46 ± 10 лет). Длительность иммуносупрессии составляла от полугода до 13,5 года (медиана 3 года). Иммуносупрессивную терапию 16 больным РПТ проводили микофенолата мофетилом, такроли- мусом и преднизолоном; 4 больных получали курсы циклоспорина А в комбинации с другими иммуносупрессивными препаратами. Группа иммунокомпетентных лиц с СК состояла из 10 мужчин и 10 женщин, в возрасте от 24 до 78 лет (средний возраст 43 ± 15 лет). Контрольная группа представлена 49 добровольцами, из них 29 мужчин и 20 женщин, в возрасте 39 ± 13 лет, у которых кожные заболевания, в том числе ассоциированные с кожными типами ВПЧ, отсутствовали. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ Statistica 10.0. Статистическую значимость различий частот определяли с помощью у2-критерия. Для проверки распределения на нормальность применяли критерий Шапиро-Уилка. При p > 0,05 нулевую гипотезу о нормальности распределения не отвергали. Для анализа характерных вирусных нагрузок рассчитывали десятичный логарифм количества вирусов. Сравнение несвязанных выборок осуществляли с использованием критерия Манна-Уитни, связанных - с помощью критерия Вилкоксона. Различия считали статистически значимыми прир < 0,05. Генодиагностику ВПЧ-инфекции проводили на базе ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора [3]. Материал забирали в стерильных условиях борами (микробиоптаты), помещали в пробирки с транспортной средой и хранили при температуре 70оС. Пробоподготовку проводили методом обработки ткани протеиназой К с последующим выделением методом аффинной сорбции на силикагеле. Определение ДНК ВПЧ рода beta в биоптатах осуществляли методом ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Амплификацию и детекцию проводили на приборе Rotor-Gene 3000 ("Corbett Research", Австралия). Для количественного определения ВПЧ рода beta, а также для оценки ее чувствительности и специфичности, использовали рекомбинантные плазмидные положительные контроли, содержащие последовательность полных геномов ВПЧ кожных типов рода альфа, гамма, ми, ни и бета и контрольные плазмиды фрагмента Р-глобинового гена человека. Для выявления ДНК ВПЧ рода beta использовали четыре системы олигонуклеотидов (группоспецифических праймеров и зондов): 3. 4. 5. 6. Детекция ДНК ВПЧ рода beta в образцах с себорейным кератозом и в образцах видимо здоровой кожи у иммуносупрессивных и иммунокомпетентных лиц Исследуемый образец Количество образцов ВПЧотрицательные образцы ВПЧположительные образцы абс. % абс. % Иммуносупрессивные: себорейный кератоз 20 3 15 17 85 видимо здоровая кожа у больных себорейным кератозом Иммунокомпетентные: 20 9 45 11 55 себорейный кератоз 20 6 30 14 70 видимо здоровая кожа у больных себорейным кератозом 20 13 65 7 35 Здоровая кожа доноров (контроль) 49 26 53 23 47 1- я - для выявления генотипов вида Р1 (типы 5, 8, 12, 14, 21. 19, 25, 47, 36); 2- я - для выявления генотипов вида Р2 (типы 9, 15, 17, 22, 23, 38, 37, 80); 3- я - для выявления генотипов вида Р3 (типы 49, 75, 76); 4- я - для выявления генотипов вида Р4 (тип 92), Р5 (тип 96), Р1 (типы 20, 24 и 93). Во все четыре системы введены олигонуклеотиды с целью выявления и количественного определения ДНК человека (по Р-глобиновому гену человека), что позволяло проводить оценку адекватности забора, хранения и обработки образцов (принцип внутреннего контроля). С учетом того, что при взятии клинического материала из очагов СК и здоровой кожи количество попадающих в образец эпителиальных клеток (а соответственно и копий вируса) варьировало, использовали методику нормирования количества вируса на количество клеток человека. Расчет нормализованной вирусной нагрузки производили по формуле: вирусная нагрузка = lg (количество ДНК ВПЧ/количество ДНК человека) . 105 [3]. Результаты Мониторинг предварительных данных (см. таблицу) показал, что у иммуносупрессивных больных (РПТ) множественные кератотические очаги появляются не только на открытых, но и на закрытых участках кожного покрова (рис. 2). В группе иммуносупрессивных пациентов с РПТ мы выявили высокую частоту ДНК ВПЧ рода beta - в 85% случаев в очагах СК и в 55% случаев на участках видимо здоровой кожи, что значимо выше, чем в группе здоровых лиц, где выявление ДНК ВПЧ рода beta отмечено лишь в 47% случаев. В группе иммунокомпетентных лиц частота выявления ДНК ВПЧ рода beta в очагах СК и на участках видимо здоровой кожи мы выявляли значимо реже - в 70 и 35% случаев соответственно. Вирусная нагрузка ДНК ВПЧ рода beta в СК и видимо здоровой коже у иммуносупрессивных пациентов с РПТ была высокой и составила 2,8 (1,9; 5,4) и 2,0 (1,3; 2,5) соответственно, поскольку распределения вирусных нагрузок носили ненормальный характер, значения представлены в виде медианы (25%о;75%о). У иммунокомпетентных лиц при анализе вирусной нагрузки в очагах СК отмечается ее уменьшение - 1,8 (1,2; 2,3), на участках видимо здоровой кожи нагрузка составила 2,2 (1,6; 1,8). Вирусная нагрузка ДНК ВПЧ в здоровой коже доноров была значимо ниже и составила всего 1,5 (0,9; 1,9). Рис. 2. Множественные себорейные кератомы на закрытых участках тела у иммуносупрессивного пациента. У РПТ с единичным СК (от 1 до 5 очагов по всему телу) ДНК ВПЧ рода beta обнаруживали в 43% случаев. При множественных очагах СК (5 и более) у РПТ отмечалась тенденция к более частому обнаружению ДНК ВПЧ рода beta - в 91% случаев. Сложность выявления ВПЧ в эпителиальных опухолях кожного покрова, вероятно, связана с ограничениями используемых методик молекулярной диагностики, при этом проведенный нами количественный анализ вирусных геномов позволил более объективно судить о характере присутствия ВПЧ в опухолях кожи. Мы считаем перспективным продолжение проведения исследований для подтверждения или опровержения роли ВПЧ рода beta в развитии эпителиальных опухолей в общей популяции и особенно среди иммуносупрессивных лиц.

About the authors

L. V Korneva

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research and Clinical Institute

Email: lvkorneva@mail.ru
Moscow, Russia

Elena S. Snarskaya

I.M. Setchenov First Moscow State Medical University

Email: snarskaya-dok@mail.ru
Moscow, Russia
MD, PhD, DSc, prof.

V. A Molochkov

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research and Clinical Institute

Moscow, Russia

A. A Polyanskaya

Premium Esthetics Clinic

Moscow, Russia

References

  1. IARC. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Human Papillomaviruses. Lyon; 2012. vol. 90.
  2. Accardi R., Gheit T. Cutaneous HPV and skin cancer. Presse Med. 2014; 43(12P2): e435-43.
  3. Кладова А.Ю., Куевда Д.А., Молочков В.А., Шипулина О.Ю., Киселев В.И., Хлебникова А.Н., Козлова Е.С. Встречаемость кожных типов вирусов папилломы человека в опухолях кожи. Альманах клинической медицины. МОНИКИ. 2006; 9: 44-50.
  4. Quint K.D., Genders R.E., de Koning M.N., Borgogna C., Gariglio M., Bouwes Bavinck J.N., Doorbar J., Feltkamp M.C. Human beta-papillomavirus infection and keratinocyte carcinomas. J. Pathol. 2015; 235(2): 342-54.
  5. Borgogna C., Lanfredini S., Peretti A., De Andrea M., Zavattaro E., Colombo E. et al. Improved detection reveals active beta-papillomavirus infection in skin lesions from kidney transplant recipients. Mod Pathol. 2014; 27(8): 1101-15.
  6. Farzan S.F., Waterboer T., Gui J., Nelson H.H., Li Z., Michael K.M., et al. Cutaneous alpha, beta and gamma human papillomaviruses in relation to squamous cell carcinoma of the skin: a population-based study. Int. J. Cancer. 2013; 133(7): 1713-20.
  7. Zhao Y.K., Lin Y.X., Luo R.Y., Huang X.Y., Liu M.Z., Xia M., Jin H. Human papillomavirus (HPV) infection in seborrheic keratosis. Am. J. Dermatopathol. 1989; 11(3): 209-12.
  8. Li Y.H., Chen G., Dong X.P., Chen H.D. Detection of epidermodysplasia verruciformis-associated human papillomavirus DNA in non-genital seborrhoeic keratosis. Br. J. Dermatol. 2004; 151(5): 1060-5.
  9. Meibodi N.T., Nahidi Y., Meshkat Z., Esmaili H., Gharib M., Gholoobi A. N evidence of human papillomaviruses in non-genital seborrheic keratosis. Indian J. Dermatol. 2013; 58(4): 326. doi: 10.4103/0019-5154.113949.

Statistics

Views

Abstract - 25

PDF (Russian) - 0

Cited-By


Article Metrics

Metrics Loading ...

PlumX

Dimensions


Copyright (c) 2015 Korneva L.V., Snarskaya E.S., Molochkov V.A., Polyanskaya A.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies