IgM Antibodies to Mycobacterium leprae Dis-BSA semisynthetic antigen in residents of an endemic and nonendemic regions of Russia

Abstract


Blood levels of IgM antibodies to Mycobacterium leprae antigen were studied in healthy donors by enzyme immunoassay. Semisynthetic analog of M. leprae species-specific phenol glycoprotein (disaccharide conjugate with bovine serum albumin - Dis-BSA) from WHO bank served as the immunoadsorbent (antigen). The incidence of serum IgM antibodies to M. leprae Dis-BSA was higher in residents of the lepra endemic Astrakhan region (3,47% of 837 tested donors) in comparison with residents of Moscow and the Moscow Region, not lepra-endemic (2,05% of 781 tested donors). These data reflected the contacts of the population with the disease agent.

Full Text

Оптимистические прогнозы экспертов ВОЗ середины прошлого столетия в отношении ликвидации лепры в мире к 2000 г., к сожалению, не оправдались. Понятие «ликвидация лепры» при этом означало, что коэффициент распространенности этого заболевания должен составлять менее 1 случая на 10 000 человек населения. К настоящему времени ле- пра ликвидирована только в 119 из 122 стран, где в 1985 г. эту болезнь признавали проблемой общественного здравоохранения. В некоторых регионах мира, таких как Ангола, Бразилия, Демократическая Республика Конго, Индия, Мадагаскар, Мозамбик, Непал, Объединенная Республика Танзания и Центральноафриканская Республика, лепра все еще остается серьезной проблемой общественного здравоохранения. По официальным данным [1], предоставленным из 115 стран мира, число новых случаев заболевания лепрой, зарегистрированных в глобальных масштабах в 2012 г., составило 232 857, что на 2,7% превысило соответствующий показатель в 2011 г. - 226 626 случаев. При этом отмечено, что 220 810 (94,8%) новых случаев заболевания лепрой были выявлены в 16 странах и лишь 12 047 (5,2%) - в других частях мира. В России эпидемиологическая ситуация, связанная с распространением лепры среди населения, относительно благоприятная, заболеваемость на протяжении многих лет характеризуется устойчивым снижением и носит спорадический характер, составив в 2012 г. 0,004% [2]. В этих условиях основной задачей противолепрозной службы в низкоэндемичных регионах по лепре остается своевременное выявление новых случаев заболевания. Для выявления случаев инфицирования или доклинических форм течения лепры среди контактных лиц и жителей эндемичных по лепре регионов используют клиническое обследование с лабораторным исследованием образцов крови с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) [3, 4]. ИФА позволяет выявлять в сыворотке крови обследуемых пациентов присутствие специфических антител классов М и/или G (IgM, IgG), вырабатываемых иммунной системой инфицированного человека. Поэтому определенные перспективы для раннего выявления субклинических форм инфекции и/или инфицированных лиц связывают с разработкой новых наборов реагентов для ИФА, основанных на применении высокоспецифичных антигенов возбудителя заболевания, позволяющих регистрировать специфические IgM для раннего выявления лепрозной инфекции на начальных этапах ее развития. В качестве антигена в составе иммуносорбента для ИФА при проведении научных исследований в настоящее время наиболее часто используют полу- синтетический аналог специфического нативного фенольного гликолипида-1 (ФГЛ-1) Mycobacterium leprae в форме дисахарида, конъюгированного с бычьим сывороточным альбумином (Dis-BSA). По мнению ряда авторов [5-10], он является специфическим маркером присутствия возбудителя лепры в организме человека. При этом выявление высокого содержания антител может свидетельствовать об активном течении инфекционного процесса [10-15]. Цель исследования - изучение содержания специфических IgM к антигену Dis-BSAM. leprae в крови у жителей эндемичных и неэндемичных по лепре регионов Российской Федерации. Материалы и методы Определение IgМ осуществляли методом твердофазного ИФА по Воллер [16] с вновь разработанным для этой цели составом набора реагентов. При создании иммуносорбента в качестве твердой фазы использовали полистироловые планшеты («Мед- полимер», Санкт-Петербург), на которых сорбировали Dis-BSA - полусинтетический антиген, предоставленный из банка ВОЗ (в соответствии с Программой о сотрудничестве между ВОЗ и ФГБУ Научно-исследовательский институт по изучению лепры Минздрава России). Концентрация антигена Dis-BSA составила 0,1 мкг/мл; иммобилизацию антигенного материала на твердую фазу осуществляли при температуре 37оС в течение 18 ч. Скрининг-титром исследуемых сывороток было выбрано разведение 1:2000, для разведения применяли фосфатносолевой буфер, содержащий твин-20 (ФСБ-твин 20), с добавлением 1% сыворотки крупного рогатого скота. Положительным контролем служила сыворотка крови больного лепроматозным типом лепры в активной стадии, отрицательным контролем - стандартная инактивированная сыворотка крови здорового донора. В качестве конъюгата, позволяющего определять формирование иммунных комплексов антиген-антитело на твердой фазе, использовали антитела диагностические к иммуноглобулинам человека, меченные пероксидазой хрена ("Invitro- gen", США), в рабочем разведении 1:2000; для разведения конъюгата использовали раствор Antibody Diluent Reagent Solution ("Invitrogen", США). Субстратной смесью служил цитратный буфер (pH 4,7-5), содержащий 4 мг тетрамитилбензидина и 2 мкл 0,003% перекиси водорода на 10 мл цитратно-фос- фатного буферного раствора. При проведении исследования на соответствующем этапе реакции после внесения в каждую лунку по 100 мкл субстратной смеси планшеты выдерживали при комнатной температуре 30 мин, реакцию останавливали добавлением в каждую лунку по 50 мкл 2,5N раствора серной кислоты (50%). Оптическую плотность (ОП) определяли на планшетном имму- ноферментном анализаторе марки Expert PLUS ("ASYS", Великобритания) при длине волны 492 нм. В разработанном нами наборе реагентов при проведении ИФА величина показателя оптической плотности (ОП) в лунках с образцами, не содержащих антитела к антигену возбудителя лепры, варьировала в интервале от 0 до 0,3 условных оптических единиц (усл. ОЕ), а с образцами, содержащими антитела указанной специфичности,- более 0,3 усл. ОЕ. В настоящем исследовании были использованы без применения дополнительных критериев отбора 837 образцов сыворотки крови здоровых доноров эндемичного по лепре региона Астраханской области, любезно предоставленных ГБУЗ АО Областной центр крови (Астрахань) и 781 образец сыворотки крови здоровых доноров неэндемичного по лепре региона (Москва и Московская область), полученные из ФГБУ Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica Version 6.0.437.0. Результаты и обсуждение ИФА с вновь разработанным нами набором реагентов 837 сывороток крови, полученных из эндемичного по лепре региона (Астраханская область), позволило получить 29 (3,47%) положительных результатов, свидетельствовавших о присутствии в этих образцах антител IgM к антигену Dis-BSA M. leprae, и 807 (96,53%) отрицательных результатов, которые указывали на отсутствие в этих образцах антител указанной специфичности. При этом показатели ОП положительных результатов варьировали в интервале от 0,3 до 1,0 усл. ОЕ, в среднем (M ± m) 0,53 ± 0,024. Показатели ОП отрицательных результатов составили от 0,001 до 0,30 усл. ОЕ (в среднем 0,12 ± 0,003) (см. таблицу). Аналогичное исследование с помощью ИФА 781 образца сывороток крови, представленных из неэндемичного по лепре региона (Москва и Московская область), позволило получить 16 (2,05%) положительных и 765 (97,95%) отрицательных результатов. При этом средние показатели ОП положи- Результаты ИФА образцов сывороток, полученных из разных регионов Российской Федерации Количество результатов ИФА (значение и %) с величиной показателя ОП в интервалах Регион 0-0,3 0,31-1 абс. % абс. % Астраханская область (n = 836) 807 96,53 29 3,47 Московская область (n = 781) 765 97,95 16 2,05 p < 0,001 < 0,05 тельных результатов составили 0,52 ± 0,033, а отрицательных результатов - 0,10 ± 0,003 (см. таблицу). Обнаружение в сыворотке крови обследуемых групп людей антител к специфичному для M. leprae антигену, представленному в форме Dis-BSA, по нашему мнению, свидетельствует о свершившемся контакте этих лиц с возбудителем лепры. Однако данный контакт у части обследованных доноров, может быть реализован в латентную инфекцию или бактерионосительство без клинических признаков заболевания. В дальнейшем у данной категории обследованных при наличии дефекта иммунной системы или возникновении других отягощающих обстоятельств возможно развитие клинических форм активной лепры. Сопоставление количественного и качественного показателей результатов лабораторного исследования образцов крови, полученных от жителей субъектов Российской Федерации, различающихся по отношению к регионам эндемичным и неэндемичным по уровню заболеваемости лепрой, позволило установить определенные различия. Так, общее количество положительных результатов при ИФА (определение антител к Dis-BSA M. leprae) обнаружили у 3,47% жителей Астраханской области (эндемичной по лепре), что было статистически значимо выше (р < 0,001), чем аналогичный показатель, полученный при исследовании образцов крови у 2,05% обследованных жителей Москвы и Московской области, региону, неэндемичному по лепре. Кроме этого, показатели величины ОП положительных результатов ИФА образцов из эндемичного по лепре региона (0,53 ± 0,024) были выше соответствующих значений, полученных в образцах из неэндемичного региона (0,52 ± 0,033) (р < 0,05). Этот факт свидетельствует о более высоком уровне содержания специфических антител в этих образцах, что является отражением более напряженного гуморального иммунного ответа, обусловленного частотой и длительностью контакта с возбудителем лепры. Изучение величины средних показателей ОП отрицательных результатов ИФА также показало более высокие значения в образцах, представленных из эндемичного региона (0,12 ± 0,003), чем в образцах сыворотки крови из неэндемичного региона (0,10 ± 0,003) (р < 0,001). Схожие результаты наблюдали S. Chanteau и соавт. [17], P. Klatser и соавт. [18], J. Douglas и соавт. [19], которые показали, что обнаружение специфических антител в сыворотках крови у жителей эндемичных по лепре регионов может свидетельствовать о наличии контакта этих лиц с возбудителем лепры независимо от появления клинических признаков заболевания, а количественные характеристики содержания антител в крови (титры антител) коррелируют с уровнем контакта с M. leprae в обществе в целом. Анализ научных публикаций позволил нам также отметить, что высокое содержание IgM к антигену ФГЛ-1 в крови жителей эндемичных регионов коррелировало с более высоким риском развития у них активной клинической инфекции [7, 10, 20-23]. Таким образом, разработанный нами набор регентов для ИФА, включающий иммуносорбент, содержащий антиген Dis-BSA M. leprae, позволяет в сыворотке крови человека определять антитела указанной специфичности, что направлено на более раннее выявление инфицированных лиц и разработку мероприятий по их клинико-серологическому диспансерному наблюдению. Различия в результатах исследования образцов крови, полученных из эндемичного и неэндемичного по лепре регионов Российской Федерации, позволило установить более частое определение и более высокое содержание специфических антител к антигену Dis-BSA M. leprae в крови жителей без клинических проявлений активного течения лепры (здоровых доноров крови), что является отражением более высокого уровня контакта населения в данных регионах с возбудителем лепры. При этом показатель серопозитивности в иммунологических тестах (ИФА) не совпадает с показателями заболеваемости и распространения лепры в данном регионе, т.е. инфицирование человека не всегда приводит к развитию клинического проявления заболевания. Контакт с возбудителем стимулирует иммунологический гуморальный ответ, выражающийся в выработке специфических антител. При возникновении погрешностей в функционировании иммунной системы бактерионосительство или реинфицирование может привести к развитию активных клинических форм лепры.

About the authors

O. V Degtyarev

Astrakhan State Medical University; Institute of Lepra Research

414000, Astrakhan, Russia

Sergey V. Rotanov

State Center of Dermatovenereology and Cosmetology

Email: rotanov@cnikvi.ru
107076, Moscow, Russia
MD, PhD, docent

Z. Ya Ibadulaev

Institute of Lepra Research

Email: zagid30@rambler.ru
414057, Astrakhan

References

  1. Информационный бюллетень ВОЗ 2014 (Январь) № 101. Available at: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs101/ru
  2. Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной лепрологии», Астрахань, 10-11 октября 2013 г. Астрахань; 2013.
  3. Klatser P.R. Serology of leprosy. Trop. Georg. Med. 1994; 46(2): 115-8.
  4. Shah D.H., Vartak R.R., Naik S.S., Dandekar S.R., Ganapati R. Epidemiological studies in children of a low endemic region, a high-endemic region, and dwellers of a leprosy colony: evaluation of anti-ND-BSA antibodies and lepromin response. Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 1994; 62(4): 539-46.
  5. Burgess P.J., Fine P.E., Ponnighaus J.M., Draper C. Serological tests in leprosy. The sensitivity, specificity and predictive value of ELISA tests based on phenolic glycolipid antigens and the implications for their use in epidemiological studies. Epidemiol. Infect. 1988; 101(1): 159-71.
  6. Zenha E.M., Ferreira M.A., Foss N.T. Use of anti-PGL-1 antibodies to monitor therapy regimes in leprosy patients. Braz. J. Med. Biol. Res. 2009; 42(10): 968-72.
  7. Frota C.C., Freitas M.V., Foss N.T., Lima L.N., Rodrigues L.C., Barreto M.L., et al. Seropositivity to anti-phenolic glycolipid-I in leprosy cases, contacts and no known contacts of leprosy in an endemic and a non-endemic area in Northeast Brazil. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2010; 104(7): 490-5.
  8. Hunter S.W., Fujiwara T., Brennan P.J. Structure and antigenicity of the major specific glycolipid antigen of Mycobacterium leprae. J. Biol. Chem. 1982; 257(24): 15072-78.
  9. Cho S.N., Yanagihara D.L., Hunter S.W., Gelber R.H., Brennan P.J. Serological specificity of phenolic glycolipid-I from Mycobacterium leprae and use in serodiagnosis of leprosy. Infect. Immun. 1983; 41(3): 1077-83.
  10. Foss N.T., Callera F., Alberto F.L. Anti-PGL-1 levels in leprosy patients and their contacts. Braz. J. Med. Biol. Res. 1993; 26: 43-51.
  11. Chin-a-Lien R.A., Faber W.R., van Rens M.M., Leiker D.L., Naafs B., Klatser P.R. Follow-up of multibacillary leprosy patients using a phenolic glycolipid-I based ELISA. Do increasing ELISA-values after discontinuation of treatment indicate relapse? Lepr. Rev. 1992; 63(1): 21-7.
  12. Goulart I.M., Penna G.O., Cunha G. Immunopathology of leprosy: the complexity of the mechanisms of host immune response to Mycobacterium leprae Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 2002; 35(4): 365-75.
  13. Дегтярев О.В., Дячина М.Н., Дуйко, В.В., Паршин М.П. Прогностическое значение сероэпидемиологического обследования при лепре. Туберкулез и болезни легких. 1995; 2: 35-7.
  14. Дегтярев О.В., Дуйко В.В., Дячина М.Н., Ибадулаев З.Я. Серологический мониторинг больных лепрой как критерий излеченности и контроля за эпидемиологической ситуацией. Российский журнал кожных и венерических болезней. 2013; 4: 29-32.
  15. Дегтярев О.В. Особенности серодиагностики у больных лепрой в стадии клинического регресса. Вестник дерматологии и венерологии. 2005; 5: 23-9.
  16. Voller A., Bidwell D.E., Bartlett A. Enzyme immunoassays in diagnostic medicines. Bull. Wld. Hith. Org. 1976; 53(1): 55-65.
  17. Chanteau S., Cartel J.L., Guidi C., Plichart R., Bach M.A. Seroepidemiological study on 724 household contacts of leprosy patients in French Polynesia using disaccharide-octyl-BSA as antigen. Int. J. Lepr. Other. Mycobact Dis. 1987; 55(4): 626-32.
  18. Klatser P.R., Cho S.N., Brennan P.J. The contribution of serological tests to leprosy control. Int. J. Lepr. Other. Mycobact. Dis. 1996; 64(Suppl. 4): S63-6.
  19. Douglas J.T., Worth R.M. Field evaluation of an ELISA to detect antibody in leprosy patients and their contacts. Int. J. Lepr. Other. Mycobact. Dis. 1984; 52(1): 26-33.
  20. Bazan-Furini R, Motta A.C., Simro J.C.L, Tarquнnio D.C., Marques W.Jr., Barbosa M.H., Foss N.T. Early detection of leprosy by examination of household contacts, determination of serum anti-PGL-1 antibodies and consanguinity. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2011; 106(5): 536-40.
  21. Cardona-Castro N.M., Restrepo-Jaramillo S., Gil de la Ossa M., Brennan P.J. Infection by Mycobacterium leprae of household contacts of lepromatous leprosy patients from a post-elimination leprosy region of Colombia. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2005; 100(7): 703-7.
  22. Cardona-Castro N.M., Beltran-Alzate J.C., Manrique-Hernandez R. Survey to identify Mycobacterium leprae-infected household contacts of patients from prevalent regions of leprosy in Colombia. Mem. Inst. Oswaldo. Cruz. 2008; 103(4): 332-6.
  23. Dessunti E.M., Soubhia Z., Alves E., Aranda C.M., Barro M.P. Leprosy: control of household contacts in the municipality of Londrina-PR for a ten-year period. Rev. Bras. Enferm. 2008; 61( Spec No): 689-93.

Statistics

Views

Abstract - 22

PDF (Russian) - 1

Cited-By


Article Metrics

Metrics Loading ...

PlumX

Dimensions


Copyright (c) 2015 Degtyarev O.V., Rotanov S.V., Ibadulaev Z.Y.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies