IgM Antibodies to Mycobacterium leprae Dis-BSA semisynthetic antigen in residents of an endemic and nonendemic regions of Russia

Full Text

Оптимистические прогнозы экспертов ВОЗ середины прошлого столетия в отношении ликвидации лепры в мире к 2000 г., к сожалению, не оправдались. Понятие «ликвидация лепры» при этом означало, что коэффициент распространенности этого заболевания должен составлять менее 1 случая на 10 000 человек населения. К настоящему времени ле- пра ликвидирована только в 119 из 122 стран, где в 1985 г. эту болезнь признавали проблемой общественного здравоохранения. В некоторых регионах мира, таких как Ангола, Бразилия, Демократическая Республика Конго, Индия, Мадагаскар, Мозамбик, Непал, Объединенная Республика Танзания и Центральноафриканская Республика, лепра все еще остается серьезной проблемой общественного здравоохранения. По официальным данным [1], предоставленным из 115 стран мира, число новых случаев заболевания лепрой, зарегистрированных в глобальных масштабах в 2012 г., составило 232 857, что на 2,7% превысило соответствующий показатель в 2011 г. - 226 626 случаев. При этом отмечено, что 220 810 (94,8%) новых случаев заболевания лепрой были выявлены в 16 странах и лишь 12 047 (5,2%) - в других частях мира. В России эпидемиологическая ситуация, связанная с распространением лепры среди населения, относительно благоприятная, заболеваемость на протяжении многих лет характеризуется устойчивым снижением и носит спорадический характер, составив в 2012 г. 0,004% [2]. В этих условиях основной задачей противолепрозной службы в низкоэндемичных регионах по лепре остается своевременное выявление новых случаев заболевания. Для выявления случаев инфицирования или доклинических форм течения лепры среди контактных лиц и жителей эндемичных по лепре регионов используют клиническое обследование с лабораторным исследованием образцов крови с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) [3, 4]. ИФА позволяет выявлять в сыворотке крови обследуемых пациентов присутствие специфических антител классов М и/или G (IgM, IgG), вырабатываемых иммунной системой инфицированного человека. Поэтому определенные перспективы для раннего выявления субклинических форм инфекции и/или инфицированных лиц связывают с разработкой новых наборов реагентов для ИФА, основанных на применении высокоспецифичных антигенов возбудителя заболевания, позволяющих регистрировать специфические IgM для раннего выявления лепрозной инфекции на начальных этапах ее развития. В качестве антигена в составе иммуносорбента для ИФА при проведении научных исследований в настоящее время наиболее часто используют полу- синтетический аналог специфического нативного фенольного гликолипида-1 (ФГЛ-1) Mycobacterium leprae в форме дисахарида, конъюгированного с бычьим сывороточным альбумином (Dis-BSA). По мнению ряда авторов [5-10], он является специфическим маркером присутствия возбудителя лепры в организме человека. При этом выявление высокого содержания антител может свидетельствовать об активном течении инфекционного процесса [10-15]. Цель исследования - изучение содержания специфических IgM к антигену Dis-BSAM. leprae в крови у жителей эндемичных и неэндемичных по лепре регионов Российской Федерации. Материалы и методы Определение IgМ осуществляли методом твердофазного ИФА по Воллер [16] с вновь разработанным для этой цели составом набора реагентов. При создании иммуносорбента в качестве твердой фазы использовали полистироловые планшеты («Мед- полимер», Санкт-Петербург), на которых сорбировали Dis-BSA - полусинтетический антиген, предоставленный из банка ВОЗ (в соответствии с Программой о сотрудничестве между ВОЗ и ФГБУ Научно-исследовательский институт по изучению лепры Минздрава России). Концентрация антигена Dis-BSA составила 0,1 мкг/мл; иммобилизацию антигенного материала на твердую фазу осуществляли при температуре 37оС в течение 18 ч. Скрининг-титром исследуемых сывороток было выбрано разведение 1:2000, для разведения применяли фосфатносолевой буфер, содержащий твин-20 (ФСБ-твин 20), с добавлением 1% сыворотки крупного рогатого скота. Положительным контролем служила сыворотка крови больного лепроматозным типом лепры в активной стадии, отрицательным контролем - стандартная инактивированная сыворотка крови здорового донора. В качестве конъюгата, позволяющего определять формирование иммунных комплексов антиген-антитело на твердой фазе, использовали антитела диагностические к иммуноглобулинам человека, меченные пероксидазой хрена ("Invitro- gen", США), в рабочем разведении 1:2000; для разведения конъюгата использовали раствор Antibody Diluent Reagent Solution ("Invitrogen", США). Субстратной смесью служил цитратный буфер (pH 4,7-5), содержащий 4 мг тетрамитилбензидина и 2 мкл 0,003% перекиси водорода на 10 мл цитратно-фос- фатного буферного раствора. При проведении исследования на соответствующем этапе реакции после внесения в каждую лунку по 100 мкл субстратной смеси планшеты выдерживали при комнатной температуре 30 мин, реакцию останавливали добавлением в каждую лунку по 50 мкл 2,5N раствора серной кислоты (50%). Оптическую плотность (ОП) определяли на планшетном имму- ноферментном анализаторе марки Expert PLUS ("ASYS", Великобритания) при длине волны 492 нм. В разработанном нами наборе реагентов при проведении ИФА величина показателя оптической плотности (ОП) в лунках с образцами, не содержащих антитела к антигену возбудителя лепры, варьировала в интервале от 0 до 0,3 условных оптических единиц (усл. ОЕ), а с образцами, содержащими антитела указанной специфичности,- более 0,3 усл. ОЕ. В настоящем исследовании были использованы без применения дополнительных критериев отбора 837 образцов сыворотки крови здоровых доноров эндемичного по лепре региона Астраханской области, любезно предоставленных ГБУЗ АО Областной центр крови (Астрахань) и 781 образец сыворотки крови здоровых доноров неэндемичного по лепре региона (Москва и Московская область), полученные из ФГБУ Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica Version 6.0.437.0. Результаты и обсуждение ИФА с вновь разработанным нами набором реагентов 837 сывороток крови, полученных из эндемичного по лепре региона (Астраханская область), позволило получить 29 (3,47%) положительных результатов, свидетельствовавших о присутствии в этих образцах антител IgM к антигену Dis-BSA M. leprae, и 807 (96,53%) отрицательных результатов, которые указывали на отсутствие в этих образцах антител указанной специфичности. При этом показатели ОП положительных результатов варьировали в интервале от 0,3 до 1,0 усл. ОЕ, в среднем (M ± m) 0,53 ± 0,024. Показатели ОП отрицательных результатов составили от 0,001 до 0,30 усл. ОЕ (в среднем 0,12 ± 0,003) (см. таблицу). Аналогичное исследование с помощью ИФА 781 образца сывороток крови, представленных из неэндемичного по лепре региона (Москва и Московская область), позволило получить 16 (2,05%) положительных и 765 (97,95%) отрицательных результатов. При этом средние показатели ОП положи- Результаты ИФА образцов сывороток, полученных из разных регионов Российской Федерации Количество результатов ИФА (значение и %) с величиной показателя ОП в интервалах Регион 0-0,3 0,31-1 абс. % абс. % Астраханская область (n = 836) 807 96,53 29 3,47 Московская область (n = 781) 765 97,95 16 2,05 p < 0,001 < 0,05 тельных результатов составили 0,52 ± 0,033, а отрицательных результатов - 0,10 ± 0,003 (см. таблицу). Обнаружение в сыворотке крови обследуемых групп людей антител к специфичному для M. leprae антигену, представленному в форме Dis-BSA, по нашему мнению, свидетельствует о свершившемся контакте этих лиц с возбудителем лепры. Однако данный контакт у части обследованных доноров, может быть реализован в латентную инфекцию или бактерионосительство без клинических признаков заболевания. В дальнейшем у данной категории обследованных при наличии дефекта иммунной системы или возникновении других отягощающих обстоятельств возможно развитие клинических форм активной лепры. Сопоставление количественного и качественного показателей результатов лабораторного исследования образцов крови, полученных от жителей субъектов Российской Федерации, различающихся по отношению к регионам эндемичным и неэндемичным по уровню заболеваемости лепрой, позволило установить определенные различия. Так, общее количество положительных результатов при ИФА (определение антител к Dis-BSA M. leprae) обнаружили у 3,47% жителей Астраханской области (эндемичной по лепре), что было статистически значимо выше (р < 0,001), чем аналогичный показатель, полученный при исследовании образцов крови у 2,05% обследованных жителей Москвы и Московской области, региону, неэндемичному по лепре. Кроме этого, показатели величины ОП положительных результатов ИФА образцов из эндемичного по лепре региона (0,53 ± 0,024) были выше соответствующих значений, полученных в образцах из неэндемичного региона (0,52 ± 0,033) (р < 0,05). Этот факт свидетельствует о более высоком уровне содержания специфических антител в этих образцах, что является отражением более напряженного гуморального иммунного ответа, обусловленного частотой и длительностью контакта с возбудителем лепры. Изучение величины средних показателей ОП отрицательных результатов ИФА также показало более высокие значения в образцах, представленных из эндемичного региона (0,12 ± 0,003), чем в образцах сыворотки крови из неэндемичного региона (0,10 ± 0,003) (р < 0,001). Схожие результаты наблюдали S. Chanteau и соавт. [17], P. Klatser и соавт. [18], J. Douglas и соавт. [19], которые показали, что обнаружение специфических антител в сыворотках крови у жителей эндемичных по лепре регионов может свидетельствовать о наличии контакта этих лиц с возбудителем лепры независимо от появления клинических признаков заболевания, а количественные характеристики содержания антител в крови (титры антител) коррелируют с уровнем контакта с M. leprae в обществе в целом. Анализ научных публикаций позволил нам также отметить, что высокое содержание IgM к антигену ФГЛ-1 в крови жителей эндемичных регионов коррелировало с более высоким риском развития у них активной клинической инфекции [7, 10, 20-23]. Таким образом, разработанный нами набор регентов для ИФА, включающий иммуносорбент, содержащий антиген Dis-BSA M. leprae, позволяет в сыворотке крови человека определять антитела указанной специфичности, что направлено на более раннее выявление инфицированных лиц и разработку мероприятий по их клинико-серологическому диспансерному наблюдению. Различия в результатах исследования образцов крови, полученных из эндемичного и неэндемичного по лепре регионов Российской Федерации, позволило установить более частое определение и более высокое содержание специфических антител к антигену Dis-BSA M. leprae в крови жителей без клинических проявлений активного течения лепры (здоровых доноров крови), что является отражением более высокого уровня контакта населения в данных регионах с возбудителем лепры. При этом показатель серопозитивности в иммунологических тестах (ИФА) не совпадает с показателями заболеваемости и распространения лепры в данном регионе, т.е. инфицирование человека не всегда приводит к развитию клинического проявления заболевания. Контакт с возбудителем стимулирует иммунологический гуморальный ответ, выражающийся в выработке специфических антител. При возникновении погрешностей в функционировании иммунной системы бактерионосительство или реинфицирование может привести к развитию активных клинических форм лепры.

About the authors

O. V Degtyarev

Astrakhan State Medical University; Institute of Lepra Research

414000, Astrakhan, Russia

Sergey V. Rotanov

State Center of Dermatovenereology and Cosmetology

Email: rotanov@cnikvi.ru
MD, PhD, docent 107076, Moscow, Russia

Z. Ya Ibadulaev

Institute of Lepra Research

Email: zagid30@rambler.ru
414057, Astrakhan

References

Supplementary files