Microarray comparative analysis of melanoma microRNA depending on the tissue fixation method

Full Text

Меланома кожи - агрессивное злокачественное новообразование с самым высоким показателем смертности среди дерматологических онкологических заболеваний [1]. В связи с трудностью терапии диссеминированных форм опухоли, важным является обеспечение максимально ранней диагностики опухоли, что зачастую включает дифференциальную диагностику с доброкачественными меланоцитарными новообразованиями кожи. В настоящее время в клинической и экспериментальной онкологии все большее внимание уделяется молекулярно-генетическому анализу опухолей с идентификацией молекулярных мишеней для дальнейшей разработки методов дифференциальной диагностики, прогноза и терапии. Так, выявление мутации V600E в гене B-RAF позволяет у больных меланомой проводить терапию ингибитором ти- розинкиназ вемурафенибом [2], а наличие мутации L576P в гене K1T - тирозинкиназными ингибиторами иматиниб и дазатиниб [3]. Еще одним методом молекулярного исследования опухоли является микрочипирование (микро- эррей), позволяющее одномоментно оценить состояние клетки по характеру экспрессии множества белков или нуклеиновых кислот. Благодаря использованию данного метода стало возможным определять одновременно целый комплекс изменений, происходящих в клетке при патологии и, в частности, при развитии онкологического процесса [4]. Микрочипирование используют для оценки уровня различных видов РНК, комплементарной ДНК, белков, а также для оценки генетического статуса организма сразу по нескольким генам [5]. МикроРНК - короткие белок-некодирующие РНК длиной 18-23 нуклеотидов, принимающие непосредственное участие в регуляции экспрессии генов [6]. Экспрессион- ные профили микроРНК в клетке являются тканеспецифичными, а также подвергаются изменениям при развитии патологических процессов. По этой причине анализ профилей микроРНК рассматривается как перспективный метод дифференциальной диагностики онкологических заболеваний, в том числе меланомы кожи. Поскольку молекулярно-генетические методы исследования относятся к разряду точных методов, требующих тщательного контроля качества, является важным правильное сохранение биопсийного материала, позволяющее впоследствии получить валидные результаты. Для сохранения РНК в образцах тканей на сегодняшний день существует ряд растворов для стабилизации РНК на основе четвертичных солей аммония, позволяющих ингибировать РНКазы. Однако в случае злокачественных новообразований многие десятилетия наиболее распро- страненным во всем мире методом сохранения гистологического материала является фиксация тканей формалином с последующим заключением в парафин (formalin fixation paraffin embedding - FFPE). Этот метод положительно зарекомендовал себя способ сохранения клеточных структур и белков в неизменном виде в течение многих лет, FFPE-биоптаты успешно применяют во всем мире для проведения клинико-морфологических и иммуноги- стохимических исследований [7]. Однако исследование нуклеиновых кислот в таких образцах может представлять серьезные затруднения. Одной из причин является возникновение химических модификаций в ДНК и РНК под действием формальдегида, что делает эти молекулы труднодоступными для исследования [8]. Вместе с тем распространенность и сравнительная «долговечность» FFPE-образцов делает их очень удобным материалом для исследований, в связи с чем остается актуальным поиск эффективного выделения нуклеиновых кислот из данного материала для дальнейших работ молекулярно-биологического профиля [9-10]. МикроРНК в отличие от матричной РНК считаются более стабильными молекулами в клетке, которые не подвергаются быстрой деградации [11]. Однако стабильность микроРНК при воздействии таких внешних факторов, как формальдегид, остается недостаточно изученной, и ее сохранение в фиксированных тканях требует дальнейшего уточнения. Целью данного исследования являлся сравнительный анализ экспрессии микроРНК в образцах меланомы в зависимости от способа фиксации материала. Материал и методы Исследование одобрено локальным этическим комитетом Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого (протокол №59/2014 от 02.12.14). Биопсийный материал меланомы (п = 3) был получен в результате оперативного иссечения в Красноярском краевом клиническом онкологическом диспансере им. А.И. Крыжановского. Образцы ткани, полученные от пациентов, были разделены на две части, одна из которых фиксировалась в стабилизирующем РНК растворе RNAlater Solution (кат. №AM7020, “Ambion”, США) и сохранялась при температуре -20°С, а вторая была подвергнута фиксации 10% раствором формальдегида и заключена в парафин по стандартной методике. С целью подтверждения гистологического диагноза меланомы кожи и оценки клинико-морфологических характеристик проводили окраску препаратов гематоксилином и эозином с последующей микроскопией. Данные о пациентах, включенных в исследование, представлены в табл. 1. Для выделения тотальной РНК стабилизированные в RNAlater образцы были подвергнуты предварительной гомогенизации. Образцы, фиксированные формалином и заключенные в парафин (FFPE), подвергали диссекции на срезы толщиной 15 мкм при помощи микротома. Полученные срезы депарафини- зировали ксилолом с последующей двукратной отмывкой 96% этанолом. По окончании пробоподготовки полученные ткани заливали раствором для лизиса клеток Digestion buffer из набора для выделения нуклеиновых кислот RecoverAll Nucleic Acid Isolation kit (“Ambion”, США) и выделяли РНК с применением этого набора по протоколу производителя. Концентрация выделенных микроРНК определялась на приборе Qubit 2.0 с использованием комплекта реагентов для определения концентрации микроРНК microRNA (“Assay”). Для постановки реакции микрочипирования использовали растворы очищенной РНК концентрации 21,2-33,2 нг/мкл. Клинико-морфологические характеристики больных меланомой кожи, включенных в исследование Таблица 1 Больной Пол Возраст, годы Уровень инвазии (по Clark) Толщина опухоли (Breslow), мм Локализация Диагноз Больная №1 Ж. 81 IV-V До 5 Правое плечо Меланома кожи Больной №2 М. 73 III 2 Правое плечо Меланома кожи Больной №3 М. 62 III-IV 3 Спина Меланома кожи Микрочипирование осуществляли с помощью системы GeneAtlas Microarray System (“Affymetrix”, США). Предварительно 8 мкл раствора очищенной РНК подвергали полиа- денилированию и биотинилированию с использованием комплекта реагентов FlashTag HSR Biotin Labeling Kit (ref. 901913; “Affymetrix”, США). Меченные биотином молекулы гибридизо- вали в течение 20 ч при температуре 48 оС на микрочипах в наборе Affymetrix miRNA 4.1 ArrayStrip (“Affymetrix”, США). По окончании гибридизации чипы отмывались и окрашивались в автоматическом режиме в промывочном модуле (Fluidic Station) системы при помощи растворов из комплекта GeneChip GeneAtlas Hybridization and Stain Module (ref. 902135) (“Affymetrix”, США). На последнем этапе осуществлялась детекция интенсивности флюоресцентного сигнала в ячейках микрочипа в модуле визуализации (Imaging Station) системы GeneAtlas. На протяжении эксперимента в работу вводили контроль качества: spike control oligos, контроль гибридизации. Контроль качества (QC) оценивали с помощью программного обеспечения автоматически на этапе детекции путем анализа флюоресцентного сигнала из ячеек микрочипа, содержащих контрольные молекулы. 0,18 ■ RNAlater ■ FFPE Рис. 1. Результаты микрочипирования образцов меланомы, фиксированных в формалине/заключенных в парафин (FFPE) и стабилизированных раствором RNAlater. а - иерархическая кластерограмма микроРНК с уровнями экспрессии, различающимися в 2 раза и более (р < 0,05). Цвет кластера от зеленого до красного отражает относительный уровень экспрессии микроРНК в соответствии с цветовым ключом. Наблюдается четкое разделение на группы в зависимости от фиксатора; б - диаграмма разброса уровней экспрессии микроРНК в образцах FFPE и стабилизированных RNAlater. Красными точками обозначены уровни микроРНК, значимо повышенные в FFPE-ткани по сравнению с фиксированной RNAlater, зелеными точками отмечены уровни микроРНК, уровень которых в FFPE-образцах ниже уровня в образце, фиксированном в RNAlater. Серые точки - уровни микроРНК, не имеющие статистически значимых различий при двух способах фиксации материала. Для подтверждения результатов микрочипирования проводили постановку ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для определения уровня экспрессии трех видов микроРНК: miR-21 (МШАТ0000076), miR-146a (MIMAT0000449) и miR-218 (MIMAT0000275) с использованием комплекта реагентов miRNA TaqMan Assays (кат. №4427975, “Applied Biosystems”, США). На первом этапе осуществляли постановку реакции обратной транскрипции с использованием специфических праймеров для обратной транскрипции (5Х) из данного комплекта, а также реагентов набора Реверта (ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии», Россия). В 8,4 мкл реакционной смеси содержалось 1,6 мкл буфера для обратной транскрипции (5X ОТ-буфер), 1,6 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (5X dNTP mix), 0,4 мкл смеси праймеров для обратной транскрипции (5X), 4 мкл раствора очищенной РНК, 0,2 мкл фермента ревертазы (1 е.а.) и 0,6 мкл РНК-элюента. Для протекания реакции обратной транскрипции смеси инкубировались при температуре 37 оС в течение 30 мин. По окончании полученные кДНК использовали для постановки реакции ПЦР-РВ. Для этого смешивали 8 мкл 2,5Х реакционной смеси для проведения ПЦР-РВ в присутствии ROX (кат. № M-431, «Синтол», Россия), 0,6 мкл смеси праймеров для ПЦР (20Х) из комплекта miRNA TaqMan Assays, 1,33 мкл кДНК и 10,07 мкл воды без нуклеаз. Реакцию проводили на приборе StepOne™ Real-Time PCR System (“Applied Biosystems”, Сингапур) при следующем температурных режимах: 50 °С - 2 мин, 95 °С - 10 мин, затем б 40 циклов: 95 °C - 15 с, 60 °C - 1 мин с детекцией по каналу FAM. Нормирование данных осуществляли по двум эндогенным контролям - U6snRNA и RNU6B (кат. №4427975, “Applied Biosystems”, США). Полученные значения пороговых циклов флюоресценции использовали для расчета относительных уровней экспрессии RQ по формуле RQ = 2"ACt, где ACt - разность значений пороговых циклов флюоресценции образца и эндогенного контроля (ACt = Ct я - Ct ). ^ .rv образца контроля' Для статистической обработки данных микрочипирования использовали программное обеспечение Transcriptome Analysis Console 3.0 (“Affymetrix”, США), с помощью непараметрический метод анализа ANOVA. Статистическую обработку данных ПЦР-РВ проводили с помощью программы Statistica 6.0 (“StatSoft”, Россия) с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Во всех экспериментах статистически значимыми считали различия в уровнях микроРНК при p < 0,05. Результаты Фиксация гистологических образцов формалином создана в первую очередь для сохранения клеточных структур и возможности их последующего морфологического и гистохимического исследования, и не преследует цели сохранения нуклеиновых кислот. В то же время стабилизирующие РНК растворы производятся с конкретной целью консервации РНК в тканях, предупреждения ее деградации и сохранения доступности для научных целей. Результаты исследований стабилизатора РНК на основе солей аммония, а также результаты сторонних исследований РНК в фиксированных таким образом тканях [12-13] позволили предположить высокую степень сохранения микроРНК в этом растворе. По этой причине данный способ фиксации РНК был рассмотрен как контрольный. По результатам микрочипирования в тканях, фиксированных формалином, по сравнению с теми же образцами, стабилизированными RNAlater, было выявлено статистически значимое изменение уровня 732 малых некодирующих РНК, из них 454 относились к классу микроРНК. При этом 51 микроРНК имела пониженный уровень в FFPE- тканях, тогда как другие 403 микроРНК были обнаружены в повышенных количествах. При иерархической кластеризации результатов (рис. 1) наблюдалось четкое разделение образцов, фиксированных формалином и стабилизированных в RNAlater, при этом порядок распределения пациентов при кластеризации оказался идентичным. Примечательно, что среди микроРНК, имеющих максимальное изменение в FFPE-образцах по сравнению с RNAlater-стабилизированными, были выявлены такие микроРНК, как miR-21-5p (повышение в FFPE в 162,15 раза), для которой описана роль онкогена в развитии различных видов рака, включая меланому [14-15], miR-146a (повышение в 40,96 раза), принимающая участие в инициации и прогрессии меланомы через активацию Notch-сигнального пути [16], miR-200c (повышение в 5,4 раза), которая рассматривается как ингибитор прогрессии меланомы и регулятор, повышающий чувствительность опухоли к терапии [17], miR-155 (повышение в 2,5 раза), описанная как опухолевый супрессор [18]. В то же время для других видов микроРНК, которые согласно исследованиям играют важную роль в меланоге- незе, значимых изменений уровня не выявлено, что может характеризовать данные микроРНК как устойчивые к воздействию формальдегида. К таким микроРНК относится miR-218 (регуляция пролиферации, миграции и инвазии) [19], miR-137 (ингибитор пролиферации) [20], miR-214 (регуляция клеточной адгезии и метастазирования) [21], miR-211 (опухолевая супрессия, регуляция инвазии) [22]. Таблица 2 Уровни микроРНК, имеющие максимально повышенный и максимально сниженный уровень экспрессии в тканях, фиксированных формалином (FFPE), в сравнении с тканями, стабилизированными раствором RNAlater МикроРНК Кратность различий уровней экспрессии в FFPE-образце в сравнении с фиксированным RNAlater* p (ANOVA) hsa-miR-21-5p 162,17 0,000534 hsa-miR-18a-5p 132,24 0,002502 hsa-miR-20b-5p 102,45 0,038588 hsa-miR-20a-5p 88,4 0,01031 hsa-miR-19b-3p 86,43 0,002182 hsa-miR-10a-5p 69,24 0,001914 hsa-miR-126-3p 63,71 0,000181 hsa-miR-130a-3p 52,56 0,000166 hsa-miR-196a-5p 49,76 0,025952 hsa-miR-151b 49,64 0,003166 hsa-miR-6746-5p -4,84 0,005206 hsa-miR-3682-3p -4,88 0,006157 hsa-miR-6875-3p -5,2 0,018077 hsa-miR-6831-5p -5,24 0,014434 hsa-miR-4298 -5,42 0,001665 hsa-miR-6838-5p -5,64 0,006032 hsa-mir-6746 -5,7 0,00664 hsa-miR-3065-5p -6,07 0,045085 hsa-miR-296-3p -7,27 0,004051 hsa-miR-3911 -8,97 0,015538 Примечание. * - положительное значение - повышенный, а отрицательное - пониженный уровень микроРНК в FFPE- образцах в сравнении со стабилизированными RNAlater. В табл. 2 представлены 10 микроРНК с максимально повышенным и 10 с максимально сниженным уровнем экспрессии. Для подтверждения данных микрочипирования посредством ПЦР-РВ были выбраны три вида микроРНК: miR-21-5p, miR-146a, miR-218, для которых ранее описаны изменения экспрессии при меланоме, а также есть указания на роль в канцерогенезе. Результаты микро- чипирования подтвердились только для miR-218, показав отсутствие значимых различий уровня экспрессии независимо от способа фиксации ткани. Для микроРНК miR-21-5p и miR-146a в отличие от данных микрочипиро- вания статистически значимых различий в уровнях экспрессии в зависимости от фиксации в FFPE или RNAlater также не выявлено (рис. 2). Обсуждение Искажение профилей РНК в тканях, фиксированных формалином в сравнении со свежими и замороженными образцами описано в ряде работ [8, 23, 24]. При этом в отношении низкомолекулярных РНК исследователи отмечали, что уровень одних молекул в образцах, фиксированных формалином, снижается, что может предполагать их разрушение, однако уровень других значимо возрастает [23]. В целом полученные нами данные согласуются с исследованиями других авторов, указывающих, что ряд miR-21 miR-146a miR-218 □ RNAlater □ FFPE Рис. 2. Подтверждение уровней микроРНК методом ПЦР-РВ. Относительные уровни экспрессии микроРНК (RQ) нормированы по контрольным микроРНК U6snRNA и RNU6B. Данные представлены в виде медианных значений, верхнего и нижнего квартилей. а - miR-21 по результатам микрочипирования имела повышенный уровень в FFPE-тканях в сравнении с тканями, стабилизированными в RNAlater, в 162,17 раза. Однако при анализе методом ПЦР-РВ значимых различий в уровнях при этих методах фиксации выявлено не было; б - miR-146a по результатам микрочипирования имела уровень в 40,96 раза выше в FFPE-тканях в сравнении с фиксированными RNAlater. Результаты ПЦР-РВ показали отсутствие значимых различий при использовании этих методов фиксации; в - miR-218 не имела значимых различий уровней в тканях, фиксированных формалином и стабилизированных RNAlater по результатам микрочипирования, и эти данные подтвердились методом ПЦР-РВ. микроРНК может подвергаться деградации при фиксации ткани в формальдегиде. В попытке объяснить эти изменения мы обратились к описанию методов фиксации и исследованиям изменений, происходящих в молекулах РНК в процессе фиксации. Согласно предположению J. Li и соавт. [25], одной из возможных причин таких изменений могут служить условия хранения образцов FFPE, поскольку парафиновые блоки с биоптатами сохраняются в архивах при комнатной температуре в условиях отсутствия защиты от РНКаз. В этом случае в процессе фиксации, а также при постфик- сационных манипуляциях открытый доступ к ткани для РНКаз может повлечь расщепление ряда молекул. Другой немаловажной причиной устойчивости ми- кроРНК к деградации и модификациям под воздействием формалина называют соединение с белком RISC, обеспечивающим ее химическую стабильность и защиту от РНКаз [25]. Однако в исследовании O. Flores и соавт. [26] показана различная степень ассоциации микроРНК в клетке с белковым комплексом RISC. S. Bail и соавт. [27] , наглядно продемонстрировав различную стабильность микроРНК в клетках, предположили, что помимо образования комплексов важную роль в стабильности молекул может играть последовательность нуклеотидов в их составе, а также возможное различие видов нукле- аз, отвечающих за расщепление той или иной молекулы. Следует отметить, что в проведенном нами исследовании также наблюдалось изменение уровня микроРНК, названных этими авторами нестабильными: miR-224, miR-382, miR-423, miR-187. Однако уровень этих микроРНК в FFPE- тканях оказался выше по сравнению с данными образцов, стабилизированных RNAlater. И еще большее повышение - до 5,73 раза в сравнении с образцами RNAlater - отмечалось для микроРНК miR-378, отмеченной S. Bail и соавт. [27] как стабильная. Невозможно не отметить факт наличия большого количества микроРНК, показавших более высокий уровень в тканях, фиксированных формалином, что также отмечается во многих научных исследованиях по изучению изменений профилей микроРНК в клетках после фиксации их формалином при последующей оценке методом микрочипирования. C одной стороны, в этом случае можно предположить, что фиксация ткани формалином происходит хоть и достаточно быстро, но не мгновенно, вызывая в клетке кратковременное состояние стресса. В этом случае в процессе воздействия формалина в клетке могут произойти изменения, вызванные повреждающим фактором и проявляющиеся в нарушении синтеза микроРНК, которые, возможно, участвуют в процессах защиты клетки от химических повреждений. С другой стороны, отсутствие корреляции между данными, полученными на микрочипах и методом ПЦР-РВ для одних и тех же образцов, указывает на возможную зависимость результатов от выбранного метода исследования. ПЦР-РВ является методом более исследованным, оптимизированным, и потому рассматривается как более точный и надежный способ определения уровня нуклеиновых кислот в клетке. Для нее существует множество работ по оптимизации и исследований по подбору эндогенных контролей, по которым нормируются полученные данные. Существует ряд исследований, в том числе и для микроРНК, которые предполагают использование различных эндогенных контролей для различных типов тканей [28, 29]. При этом показано, что используемые в качестве контролей молекулы являются более или менее стабильными на разных этапах жизни или при различных состояниях организма. Однако нам не удалось найти исследований о сохранении устойчивости эндогенного контроля к химическим модификациям при использовании формаль- дегидного фиксатора. Вероятно, поэтому остается открытой проблема воздействия формальдегида на эндогенный контроль, в том числе в зависимости от типа ткани. Полученные нами данные для меланомы лишь частично согласуются с результатами сравнительного исследования замороженных и FFPE-тканей меланоцитарных невусов, полученных M. Glud и соавт. [23]. Поэтому возможно предположить, что при сравнении профилей микроРНК в различных тканях методом микрочипирования будут отмечаться искажения профиля, связанные не только с патологическими процессами, но и с модификацией молекул в процессе фиксации тканей. При этом именно исследования действия формалина на нуклеиновые кислоты указывают на значительные изменения РНК в процессе фиксации - деградация, снижение ее доступности в связи с формированием перекрестных связей с белками или иными химическими модификациями под действием формальдегида [30]. Следовательно, стоит предположить, что анализ данных микрочипирования FFPE-образцов требует осторожности в интерпретации и дальнейшего изучения. Аналогичными проблемами можно охарактеризовать применение FFPE-образцов для генетического анализа на основе секвенирования. Таким образом, использование биоптатов кожи, фиксированных в формалине и залитых в парафин, для задач молекулярной диагностики на данном этапе может приводить к искажению результатов экспрес- сионного анализа.

About the authors

A. V Komina

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

660022, Krasnoyarsk, Russia

N. V Palkina

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

660022, Krasnoyarsk, Russia

M. B Aksenenko

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

660022, Krasnoyarsk, Russia

Tatyana G. Ruksha

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Email: tatyana_ruksha@mail.ru
MD, PhD, DSc., Head of Department of pathophysiology, KGMU n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky 660022, Krasnoyarsk, Russia

References

Supplementary files