Analysis of the frequency of NRAS and c-Kit gene mutations in patients with BRAF-negative melanoma

Full Text

Меланома кожи представляет собой злокачественное новообразование, характеризующееся быстрым мета- стазированием, высоким риском рецидивирования [1]. Проблема лечения меланомы остается особенно актуальной в связи с высоким процентом резистентности к традиционным схемам химиотерапии. Терапия меланомы на современном этапе представляет собой комплекс мероприятий, направленных на блокаду основных сигнальных путей, специфичных для меланомы кожи, при помощи препаратов блокирующих продукты онкогенов. Меланома относится к опухолям, характеризующимся высоким процентом мутаций по сравнению с другими опухолями - при полногеномном секвениро- вании 105 образцов меланомы выявлено 86 813 кодирующих мутаций, всего было мутировано 78 генов [2]; для сравнения при раке толстой и прямой кишки было мутировано 32 гена [3]. В соответствии с данными литературы, этот факт рассматривают как следствие воздействия на кожу ультрафиолетового (УФ) излучения в процессе жизни человека, отмечая, что наиболее частый и специфичный вид мутаций в геноме, возникающих под влиянием данного фактора - это транзиция С > T (замена цитозина на тимин) [4]. При этом большое значение отводится молекулярно-генетическому подтипу меланомы кожи, поскольку одним из основных патогенетических звеньев при меланоме кожи является гиперактивация сигнального каскада RAS-RAF-MEK-ERK, которая наиболее часто достигается путем мутации в гене BRAF [5]. В 50-70% случаев мутация в гене BRAF происходит в 600-м кодоне 15-го экзона [6]. Таким образом, меланомы, имеющие мутации в данном экзоне, можно объединить в группу так называемых BRAF-позитивных меланом. Другой молекулярно-генетической подгруппой являются BRAF-негативные меланомы. Как правило, данные меланомы имеют «драйверные» мутации в других генах, наиболее часто в генах NRAS и c-Kit. Мутации в гене NRAS наиболее часто наблюдаются в 12-м и 13-м кодоне 2-го экзона, а также в районе 61-го кодона 3-го экзона [7]. Активирующие мутации в гене Kit затрагивают 9, 11, 13, 17 и 18-й экзоны. По данным литературы мутация гена c-Kit в 11-м экзоне ассоциирована с гиперэкспрессией мутантного белка, определяемого иммуно- гистохимическим методом [8]. Данный протоонкоген кодирует трансмембранный тирозинкиназный рецептор фактора роста стволовых клеток - KIT/SCF-R, оказывая влияние на миграцию и пролиферацию меланоцитов [9]. Различия в мутационном статусе меланом кожи ассоциировано также с различными дерматоскопичес- кими особенностями новообразования: определено, что в меланомах, имеющих мутации в MAPK (мито- генактивированные протеинкиназы) каскаде BRAF и NRAS, характерно наличие дерматоскопической картины типа «молотый черный перец» - структуры регресса меланомы, что является морфологическим следствием иммунологического поведения опухоли [10]. Целью данного исследования стало исследование на наличие мутаций в 59-62-м кодонах 3-го экзона гена NRAS и 576-м кодоне 11-го экзона гена c-Kit у больных меланомой кожи с негативным BRAF-статусом. Материал и методы Анализ данных историй болезней больных меланомой кожи осуществляли на базе КГБУЗ «Красноярский краевой онкологический диспансер», исследование одобрено локальным этическим комитетом, протокол №52/2013 от 27.11.13. Биоптаты больных меланомой кожи были получены в КГБУЗ «Красноярское краевое патологоанатомическое бюро». Перед выделением ДНК стекла с биоптатами больных меланомой кожи, окрашенные гематоксилином и эозином, оценивали на предмет содержания опухолевых клеток в срезе, отбирали образцы с содержанием опухолевых клеток 60% и более. В дальнейшем проводили выделение геномной ДНК с помощью набора ДНК-сорб В (“AmpliSens”, Россия). На первом этапе работы проводили анализ мутации BRAF-V600E методом аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени (п = 80). На следующем этапе исследования были отобраны 37 больных, имеющих BRAF-негативный статус. Затем проводили постановку реакции амплификации ПЦР; для приготовления ПЦР-смеси использовали набор Encyclo Plus PCR kit («Евроген», РФ); ПЦР-смесь готовили в количестве 25 мкл в расчете на одну реакцию. Состав ПЦР-смеси включал следующие компоненты: 10X Encyclo буфер 2,5 мкл (для c-Kit был использован 2xGC-буфер) стерильная вода для ПЦР, 50xDNTP 0,5 мкл, PCR-праймер (прямой) и PCR-праймер (обратный) по 1 мкл, ДНК матрица 2,5 мкл, 50X Encyclo полимераза. Последовательность праймеров для гена NRAS (codon 59-62): forward 5'-ATAGCATTG- CATTCCCTGTG, reverse 5'-GCGGATATTAACCTCTACAGG. Последовательность праймеров для гена c-Kit (codon 576). Условия ПЦР (NRAS): предварительная денатурация 95 °С - 3 мин, далее денатурация 95 °С - 30 с, отжиг 54 °С - 40 с, элонгация 72 °С - 40 с; всего: 38 циклов, в завершении финальная элонгация 72°С - 3 мин. Условия ПЦР (c-Kit): 95 °С - 3 мин, 95 °С - 30 с, 53°С - 40 с, 72 °С - 40 с, 72 °С - 3 мин, 41 цикл, - 5’ - {c-Kit forward) 5'-CCAGAGTGCTCTAAT- GACTG-3’, reverse - 5’-AGCCCCTGTTTCATACTGAC-3’. Для подтверждения эффективности ПЦР проводили электрофоретическое разделение молекул в 2% агарозном геле при напряжении 90V/см в течение 40 мин с последующей окраской геля в растворе бромистого этидия с финальной концентрацией раствора 0,2 мкг/мл. После чего производили визуализацию геля на фильтре УФ трансиллюминатора. Результат реакции считали положительным, если на геле четко были видны светящиеся полосы, соответствующие молекулярной массе ампликона. Для NRAS молекулярная масса ДНК-фрагмента составляла 190 пн, для c-Kit - 215 пн. Далее проводили очистку ДНК. Выделение концентрированных образцов двухцепочной ДНК из реакционной смеси проводили с помощью набора Cleanup Mini («Евроген», РФ). После чего повторно проводили электрофорез в 2% агарозном геле с целью выяснения количества ПЦР-продукта по интенсивности свечения полос. Для постановки одной реакции секвенирования использовали 10 мкл раствора, содержащего очищенный целевой продукт с концентрацией 20- 50 нг/мкл. Секвенирование проводили методом Сэнгера с последующим анализом хроматограмм в программе Sequence scanner 1,0 (“Applied Biosystems”). Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 7,0. Проверку нормальности распределения выборки производили с помощью критерия Колмогорова- Смирнова. Статистическую значимость различий определяли с помощью критерия Манна-Уитни. Для оценки качественных признаков применяли точный односторонний критерий Фишера. При р < 0,05 различия признавали статистически значимыми. Результаты При проведении исследования мы выявили мутации в 62-м кодоне 3-го экзона гена NRAS в 8,1% случаев, связанные с заменой глутаминовой кислоты на лизин, GAA > AAA (см. рисунок). Оценка клинических характеристик больных меланомой выявила, что средний возраст больных с наличием NRAS-мутации составил 69,6 ± 12,2 года и был выше, чем у NRAS-негативных больных (р < 0,05). Кроме того, в исследуемой выборке все пациенты, имеющие данный вид мутации, были женского пола (р < 0,05). Первичная меланома была акрально-ленти- гинозной формы у 33,4% больных, поверхностно-рас- пространяющейся формы - у 33,2%, узловой формы - у 33,4%. Более чем у 50% пациентов опухоль локализовалась на нижних конечностях, и данная локализация опухоли преобладала над другими анатомическими локализациями (р < 0,05). Оценка морфологических характеристик данного вида опухоли выявила, что в 67% случаев толщина опухоли по Бреслоу составила более 4 мм. Во всех случаях NRAS-положительные меланомы имели эпителиоидно-клеточную гистологическую структуру и более высокий митотический индекс, чем NRAS-негативные меланомы (р < 0,05). Анализ результатов секвенирования по Сэнгеру. а - хроматограмма пациента, не имеющего мутации в гене NRAS - Wild type (дикий тип); б - хроматограмма пациента имеющего мутацию в 62-м кодоне 3-го экзона гена NRAS (мутантный тип). Мы наблюдали «молчащие» мутации в 64,7% случаев в кодонах 39, 41, 57, 78, 81 3-го экзона гена NRAS. При данном виде мутаций наблюдается замена нуклеотида, не приводящая к изменению кодируемой им аминокислоты, что связано с вырожденностью генетического кода. У 26,7% пациентов, имеющих отрицательный BRAF-статус, не выявлено мутаций ни в гене NRAS, ни в гене c-Kit. По данным литературы [11], мутации онкогенов BRAF, NRAS, с-Kit не обнаруживаются в 30% случаев меланом кожи. Клинико-морфологические особенности больных BRAF-негативной меланомой по сравнению с ее мутантным подтипом представлены в таблице. Обсуждение Под воздействием на кожу УФ-излучения в опухоли происходит интенсивный мутационный процесс, чем может быть объяснено помимо миссенс-мутаций у пациентов в данной выборке наличие множественных «молчащих» мутаций. Гены с низким уровнем экспрессии имеют очень высокую скорость развития соматических мутаций [12]. Клинико-морфологические особенности BRAF-негативных меланом кожи Клинико-морфологический BRAF-негативные меланомы кожи BRAF-позитивные меланомы показатель NRAS-позитивные меланомы кожи NRAS-негативные меланомы кожи Средний возраст пациентов, годы 69,6 ± 12,2 62,02 ± 13,9 56 ± 13,4 Пол Преобладали женщины Нет взаимосвязи с полом пациентов Нет взаимосвязи с полом пациентов Локализация опухоли Преимущественно локализуются на конечностях у пациентов Не выявлено статистически значимой взаимосвязи Кожа туловища, кожа закрытых участков тела Клинико-морфологическая Равномерное Не выявлено статистически значимой Не выявлено форма меланом распределение меланом с различными клиникоморфологическими подтипами взаимосвязи. Несмотря на отсутствие мутаций в гене с-Kit, следует отметить, что при наличие данного вида мутаций преобладает акрально-лентигинозная локализация меланомы кожи [16] статистически значимой взаимосвязи Толщина по Бреслоу В 67,7% толщина опухоли более 4 мм В 27,6% толщина опухоли превышала 4 мм В 39,4% толщина опухоли превышала 4 мм Гистологический подтип Преобладал эпителиоидно-клеточный тип Преобладал эпителиоидно-клеточный и смешанный типы Нет статистически значимых различий между гистологическим подтипом и BRAF мутацией Митотический индекс Высокий Высокий Средний Наличие мутаций в гене с-Kit Вместе не встречаются В данной выборке не выявлено, но такое сочетание возможно Встречаются в единичных случаях совместно Другой молекулярно-генетической особенностью у больных данной выборки было отсутствие мутаций в генах NRAS и c-Kit у BRAF-негативных пациентов, что, в свою очередь, можно объяснить рядом причин. Во-первых, данные меланомы могут относиться к группе так называемых «паннегативных» меланом, у которых отсутствуют основные виды мутаций имеющихся в меланомах [13]. Во-вторых, в этих образцах меланомы могли быть активированы другие «драй- верные» гены, такие как PDGFRA и KRAS. В-третьих, имеются данные об образовании так называемых BRAF-химерных белков, слитых химерных белков PAPSS1 - BRAF, TRIM24 - BRAF, которые содержат серин-треонинкиназный домен и обладают киназной активностью белка BRAF [14]. Данные меланомы часто имеют также «паннегативный» статус, при этом данный вид меланом резистентен к терапии BRAF- ингибиторами, но чувствителен к терапии MEK- ингибиторами. В-четвертых, возможно присутствие у данных пациентов более редких вариантов мутаций в анализируемых генах NRAS и c-Kit, но в других неисследованных экзонах. Следует также отметить, что мутации в генах NRAS и с-Kit могут иметь различное биологическое значение. Мутации 2-го экзона гена NRAS затрагивают чаще кодоны 12 и 13, и их возникновение, как правило, ассоциировано со стадией инициации канцерогенеза при меланоме кожи. Мутации экзона 3 района 61 кодона, как правило, обнаруживаются на более поздней стадии и ассоциированы с прогрессией заболевания и развитием метастазов меланомы кожи [15]. Различие в мутационном статусе BRAFнегативных меланом определяет и терапевтические подходы к данному заболеванию. Так, при наличии NRAS-мутации, клетки меланомы при передаче дальнейшего сигнала на киназу ERK используют преимущественно киназу CRAF, а не BRAF [16], в связи с этим для данной группы больных используют ингибиторы киназы MEK [17], такие как траметиниб, селуметиниб и MEK 62. Терапия BRAF-ингибиторами у данной группы пациентов не используется, что связано с тем, что увеличение активности белка RAS в результате мутаций в гене NRAS приводит к развитию приобретенной резистентности к препаратам- ингибиторам BRAF. Говоря о мутациях в гене c-Kit, следует отметить, что такие опухоли чувствительны к иматинибу и другим тирозинкиназным ингибиторам [18]. В проводимых ранее исследованиях показано, что BRAF-негативные меланомы обладают более низкой инвазивной способностью, что может также иметь значение при определении тактики ведения данных больных [19]. Определение мутационного статуса больных меланомой кожи является важным шагом в выборе тактики ведения пациентов и подборе персонифицированной терапии в данной группе больных. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ, проект № 16-34-00461, мол_а» (часть исследования по секве- нированию и анализу данных мутаций в гене NRAS). Публикация выполнена при финансовой поддержке краевого государственного автономного учреждения «Красноярский краевой фонд поддержки научной и научно-технической деятельности» Протокол № 46 от 27 мая 2016 г. (стажировка сотрудников М.Б. Аксененко, А.В. Коминой по теме «Молекулярная онкология» по основам биоинформационного анализа данных секвенирования). Публикация выполнена в рамках гос. задания «Разработка методов детекции и идентификация мутаций гена c-Kit на основе технологий ПЦР в режиме реального времени и секвенирования для выбора средств персонифицированной терапии меланомы» (секвенирование и анализ данных мутаций гена c-Kit).

About the authors

Maria B. Aksenenko

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Email: aksenenko_mariya@mail.ru
MD, PhD, docente, Department of Pathophysiology with a Course of a Clinical Pathophysiology Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

A. V Komina

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Department of Pathophysiology with a course of clinical pathophysiology Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

T. G Ruksha

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Department of Pathophysiology with a course of clinical pathophysiology Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

References

Supplementary files