Integrative virogeny of skin-type beta papillomaviruses with concurrent progressive dermatoheliosis as a potential risk of malignant carcinogenesis

Full Text

По данным международной литературы известно, что около 20% всех неопластических процессов у человека развиваются в результате воздействия целого ряда так называемых онкогенных вирусов. Экспертами Международного агентства по изучению рака (МАИР) в качестве онкогенных рассматриваются в том числе папилломавирусы человека (вирус папилломы человека, ВПЧ; human papilloma virus, HPV) [1]. Потенциальные онкогенные свойства большинства папилломавирусов связаны с их способностью нарушать дифференцировку и индуцировать пролиферацию эпителиоцитов кожи и слизистых оболочек, что клинически реализуется в виде целого спектра эпителиальных неоплазий с высокими рисками злокачественной трансформации при наличии определённых эпигенетических факторов. Папилломавирусы кожного типа рода beta инфицируют клетки эпителия кожи, что и определяет спектр клинических мишеней, которыми являются морфологические структуры эпидермиса кожи [2]. Онкогенная стратегия канцерогенных папилломавирусов усиливается рядом механизмов, которые повышают агрессивность опухолевого роста. Важной особенностью этих механизмов является так называемая интегративная вирогения, т.е. включение вирусного генома в состав клеточных хромосом [3, 4]. Процессы интеграции, которые иногда встречаются и при доброкачественных опухолях, присущи большинству инвазивных карцином и предраковых неоплазий, существенно влияют и определяют взаимоотношения вируса с ДНК клетки. Интеграция способствует общей дестабилизации клеточного генома, предрасполагая к серии необратимых мутаций. Накопление массы мутировавших клеток ведёт к селекции инвазивных клонов клеток. Наиболее ярко это продемонстрировано на примере цитогенетической динамики HPV-индуцированной малигнизации – поликлональности их первичных поражений при генитальных опухолях [2].

Так, HPV-ДНК обнаружена в хромосомах нескольких клеточных линий, полученных из генитальных опухолей. В частности, линия клеток HLА цервикальной аденокарциномы содержит геном HPV-18 [2].

Согласно одной из гипотез, HPV кожного типа рассматривают как кофактор промоции опухолевого роста клеток уже повреждённых опухольинициирующими эпигенетическими факторами, и прежде всего длительным воздействием ультрафиолетового (UV) излучения [5, 6]. Процесс может длиться годами, незаметно приводя к развитию злокачественных эпителиальных опухолей, преимущественно на открытых участках кожного покрова. Малигнизация возникает в результате многолетних поэтапных изменений структур эпидермиса, которые варьируют от незначительных доброкачественных до выраженных злокачественных дисплазий [5, 6].

По данным многочисленных исследований [6–10], главная роль в развитии немеланоцитарных эпителиальных опухолей кожи принадлежит UV-облучению. Повреждающее действие на ДНК кератиноцитов оказывает UV-облучение В-спектра с длиной волны 280–320 нм (UVВ), что приводит к появлению клеточных мутаций [6]. В случае возникновения мутаций в генах, контролирующих клеточных цикл, репарацию ДНК и апоптоз, запускается процесс фотоканцерогенеза [6]. При избыточной инсоляции зафиксировано образование мутантных форм онкобелка р53, повышение образования антиапоптотического белка Bcl-2, подавление экспрессии Fas-рецепторов [7]. В дополнение к прямому влиянию на клеточный цикл кумулятивное UV-излучение вызывает как локальную, так и системную иммуносупрессию, блокируя противоопухолевый контроль, который в противном случае распознал бы высокоантигенную кожную опухоль [8]. На коканцерогенез указывает и злокачественное перерождение элементов на открытых участках кожи, например при веррукозной эпидермодисплазии [8, 9], что подтверждает роль UVВ в экспрессии HPV-5 и HPV-8 с последующей индукцией и ускорением опухолевого роста [9]. Кроме того, малигнизации способствуют иммуносупрессивные состояния (нарушения клеточного иммунитета; ВИЧ-инфекция; фармакологическая иммуносупрессия, в частности глюкокортикостероидные, цитостатические препараты; герпетическая инфекция, коинфицирование несколькими HPV-типами, многократные беременности, курение) [10]. Имеет значение и генетическая предрасположенность, которая влияет на чувствительность клеток к инфицированию, способность к элиминации вирусов и длительность инкубационного периода [10]. Ряд популяционных исследований, молекулярные и патоморфологические данные подтверждают, что HPV рода beta могут играть этиологическую роль в развитии эпителиальных опухолей, иммуносупрессия является важным кофактором развития эпителиальных образований кожи [4–6]. Формирование HPV-ассоциированных бородавок, базально-клеточных папиллом, ороговевающих кожных опухолей (кератозы) и немеланомных видов рака кожи значимо повышается после трансплантации внутренних органов [3]. В последнее время стало очевидным, что простое обнаружение HPV в немеланоцитарных эпителиальных опухолях кожи не может являться прямым доказательством этиологической роли HPV в развитии данных состояний. Обнаружение HPV в патологически изменённом эпителии кожи может быть следствием как активной вирусной инфекции, так и независимой бессимптомной персистенции, характерной для условно-патогенных инфекционных агентов. Поэтому помимо выявления HPV необходимо проводить измерение вирусной нагрузки [11–13].

Определение вирусной нагрузки является новым подходом в диагностике HPV-инфекции, уже показавшим свою высокую значимость в мониторинге течения и прогрессирования генитальной папилломавирусной инфекции [11, 12]. Таким образом, в настоящее время не вызывает сомнений необходимость проведения количественного анализа вирусных геномов в немеланоцитарных эпителиальных опухолях кожи, что позволит более объективно судить о характере присутствия HPV в опухолях кожи, а следовательно, глубже понимать механизмы, связывающие немеланоцитарные эпителиальные опухоли кожи с HPV. Сегодня доступны антитела для иммуноцитохимического определения общего (родоспецифического) антигена папилломавирусов, но их чувствительность недостаточна для надёжного диагноза. Серологическая диагностика (определение анти-HPV антител) также малочувствительна и не получила широкого применения. С целью прогностического обнаружения канцерогенных свойств HPV при эпителиальных дисплазиях целесообразно использовать метод молекулярно-генетического анализа, т.е. выявление HPV-ДНК.

Цель исследования – изучение встречаемости и степень вирусной нагрузки ДНК HPV рода beta у 80 пациентов (из них 42 с дерматогелиозом IV степени по Глогау и 38 без дерматогелиоза) и 40 здоровых доноров.

Материал и методы

Работа выполнена на кафедре кожных и венерических болезней имени В.А. Рахманова Института клинической медицины им. Н.В. Склифосовского ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет) в период 2018–2020 гг.

В исследование были включены 80 пациентов (37 мужчин и 43 женщины), находившихся на лечении или амбулаторно-консультативном приёме в клинике кожных и венерических болезней им. В.А. Рахманова Университетской клинической больницы № 2 и отделении ЛДО УКБ № 2 «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова», и 40 здоровых добровольцев (рис. 1).

 

Рис. 1. Гендерный состав пациентов основных групп.

 

Все пациенты обследованы согласно российским клиническим рекомендациям (2016): общий анализ крови, биохимическое исследование крови, иммуноферментный анализ крови на ВИЧ-инфекцию, сифилис, HBsAg, HCV, общий анализ мочи.

Лабораторное исследование клинических и биохимических параметров крови проводили в Межклинической биохимической лаборатории (руководитель В.Г. Тугаринова).

Всем пациентам выполнено клинико-морфологическое обследование.

Клинико-анамнестическое обследование включало сбор жалоб, анамнеза жизни и заболевания, оценку клинических проявлений и определение их степени тяжести, при этом из данных анамнеза важными являлись возраст и пол пациентов, фототип кожи, длительность заболевания и количество высыпаний, ассоциированных с кожными типами HPV, наличие признаков фотостарения; наличие эпителиальных неоплазий на открытых участках кожного покрова (пациенты заполняли разработанный нами опросник) (табл. 1).

 

Таблица 1.Опросник для пациентов на наличие факторов риска развития фотоиндуцированной патологии кожи

Вопрос	Данные анамнеза (да/нет)
UV-облучение	·             Хроническая неконтролируемая инсоляция с детского возраста ·             Посещение солярия: – длительность процедур – частота сеансов ·             Смена климатических условий на более агрессивные по UV-излучению: – редко – регулярно ·             Эпизоды сильных солнечных ожогов кожи в течение жизни: – да (1 или более) – нет
Пол	Женщина / мужчина
Конституциональный тип фоточувствительности кожи по Фицпатрику	·                I мелано-дефицитный тип ·                II мелано-дефицитный тип ·                III мелано-компетентный тип
Осведомлённость о необходимости регулярного применения фотопротекторов	·                Низкая ·                Крайне низкая ·                Отсутствует
Адекватность профилактических мер защиты кожи	·                Эпизодическое применение средств фотопротекции ·                Никогда не применяет средства фотопротекции ·                Применяет, но: – фотопротекция низкого качества – с низким фактором защиты (менее 15 SPF) – крем и пластиковые солнцезащит- ные очки без UV-фильтров
Наличие эпителиальных неоплазий на открытых участках кожного покрова (папилломы, фиброэпителиальные полипы, солнечное лентиго)	·                Нет ·                Есть: – единичные – множественные

Осмотр дерматовенеролога включал:

• установление фототипа кожи пациента по шкале Фицпатрика [14];
• клиническую оценку стадий фотостарения (дерматогелиоз) по Р. Глогау [14];
• клиническую оценку степени выраженности дерматогелиоза с помощью адаптированной шкалы SCINEXA [15].

В результате анализа результатов опросников и клинических признаков степени фотостарения по Глогау мы провели распределение всех участников исследования на две основные группы.

В 1-ю группу (иммуносупрессивная) вошли 42 пациента с выраженными клиническими признаками фотостарения IV степени по Глогау (18 мужчин и 24 женщины) в возрасте 46,5 ± 6,5 года. Все пациенты этой группы имели скомпроментированный анамнез по данным опросника.

Во 2-ю группу (иммунокомпетентная) вошли все остальные пациенты без признаков фотостарения (n = 38), из них 16 мужчин и 22 женщины в возрасте 51,0 ± 5,6 года. Пациенты этой группы применяли фотопротекторы и не злоупотребляли солнечной инсоляцией.

Группу контроля составили 40 человек (17 мужчин и 23 женщины) – здоровых доноров в возрасте 50 ± 5,1 года, у которых отсутствуют кожные заболевания, в том числе ассоциированные с кожными типами HPV.

С целью клинической оценки дерматогелиоза была использована адаптированная шкала SCINEXA, содержащая 5 параметров для оценки степени хронологического старения кожи и 17 параметров, характеризующих изменения кожи вследствие кумулятивного эффекта UV-излучения у пациентов 1-й и 2-й групп.

Поскольку клинической оценке подвергался весь кожный покров (открытые и закрытые участки кожи), участникам исследования выполнены следующие диагностические процедуры:

• дерматоскопическое исследование для верификации доброкачественных и злокачественных неоплазий;
• цитологическое исследование кожи и слизистых оболочек при наличии эпителиальных неоплазий;
• генодиагностика HPV-инфекции.

Клинические признаки дерматогелиоза характеризовались по следующей схеме: 0 – отсутствие признака, 1 – слабая выраженность признака (I степень), 2 – умеренная выраженность признака (II степень), 3 – сильная выраженность признака (III степень) [15].

Исследования проводили на базе ФГУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора», Москва (далее ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Микробиоптаты ткани получены с помощью малоинвазивной модификации взятия биопсии бритвенным способом, или методом соскоба (для получения суспензии клеток) с поверхности очагов дисплазии (базально-клеточных папиллом, аденом, фиброэпителиом, бородавок, кератоакантом, актинических кератом, карцином кожи) и из участков видимо здоровой кожи, закрытых от воздействия UV-излучения, у 80 пациентов и 40 здоровых доноров.

Методы. Исследуемый клеточный материал помещали в пробирки, содержащие по 1 мл транспортной среды (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Для максимального сохранения количества клеточной и вирусной ДНК пробирки замораживали сразу после взятия материала и хранили до проведения ПЦР-анализа при температуре -70 °С. Пробоподготовку исследуемого материала проводили методом обработки ткани протеиназой К с последующим выделением ДНК методом аффинной сорбции на силикагеле с использованием набора для выделения «ДНК-сорб С» в соответствии с инструкцией производителя (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Элюцию проводили в 100 мкл ТЕ-буфера. Образцы, содержащие очищенную ДНК, использовали в реакции амплификации нуклеиновых кислот. Для разработки методики количественного определения HPV рода beta, а также оценки её чувствительности и специфичности использовали рекомбинантные плазмидные положительные контроли, содержащие последовательность полных геномов HPV кожных типов рода alpha, gamma, mu, nu и beta – 1, 3, 4, 5, 7, 8, 15, 20, 24, 27, 37, 38, 49, 50, 65 (M. Favre Institut Pasteur, Unite Postulante Genetique, Papillomavirus et Cancer Humain, Франция; E.M. de Villiers, Abteilung tumorvirus-Charakterisierung Referenzzenturum fur Humanpathogene Papillomviren, Германия), а также контрольные плазмиды фрагмента β-глобинового гена человека (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора).

Для выявления ДНК HPV рода beta использовали четыре системы олигонуклеотидов (группоспецифических праймеров и зондов):

• 1-я – для выявления генотипов вида β1 (5, 8, 12, 14, 21, 19, 25, 47, 36);
• 2-я – для выявления генотипов вида β2 (9, 15, 17, 22, 23, 38, 37, 80);
• 3-я – для выявления генотипов вида β3 (49, 75, 76);
• 4-я – для выявления генотипов вида β4 (92), β5 (96), β1 (20, 24 и 93-й типы).

Последовательности всех олигонуклеотидов для 25 типов HPV рода beta были выбраны при анализе известных последовательностей HPV, взятых из интернет-ресурса NCBI GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), и обработаны с помощью программы AlignX пакета Vector NTI 6 (InforMax Inc., 2000). Во все четыре системы введены олигонуклеотиды к последовательности β-глобинового гена человека с целью соблюдения принципа внутреннего контроля (оценки адекватности забора, хранения и обработки образцов).

Выявление ДНК HPV в образцах ткани проводили в четырёх пробирках. Каждая пробирка содержала одну из групп олигонуклеотидов для выявления HPV, а также олигонуклеотиды для выявления β-глобинового гена человека.

В состав реакционных смесей для полимеразной цепной реакции (ПЦР) входили следующие компоненты:

• олигонуклеотидные праймеры и зонды;
• нуклеотиды в концентрации 0,2 мМ каждого;
• ПЦР-буфер (66 мМ Tris-HCl, Ph 8,8, 17 мМ (NH4)₂SO₄, 4 мM MgCl₂, 0,01% Tween 20);
• TaqF-ДНК-полимераза (2U в реакцию) (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора);
• очищенная ДНК, выделенная из клинического материала – 10 мкл.

В отдельные пробирки (вместо образца ДНК) вносили положительные и отрицательные контрольные образцы (10 мкл).

Отрицательный контроль амплификации представлял обычную реакционную смесь, в которую вместо образца ДНК добавляли ТЕ-буфер.

Положительный контроль амплификации представлял собой фрагмент специфичной ДНК (контрольные плазмиды HPV в концентрации 10⁴ копий ДНК HPV/мл). Процедуру термоциклирования проводили на амплификаторе Mx3000P (Stratagene, США) с адаптированным компьютером по следующей программе: предварительный этап при температуре 95 °С – 15 мин, затем при 95 °С – 15 с, при 60 °С – 30 с, при 65 °С – 1 мин. Всего 50 циклов.

Продукты амплификации выявлялись путём измерения флюоресцентного сигнала, нарастающего по мере накопления специфического продукта реакции. При положительной реакции кривая флюоресценции имела характерный S-образный вид. В соответствии с этим мы проводили качественную оценку результатов реакции. Для количественного анализа использовали десятикратные разведения (6 log – 1 log) положительных плазмидных контролей 5, 8, 15, 37, 38, 20, 24, 49-го типов HPV и ДНК человека (стандарты).

Для построения и математической обработки описанных кривых использовали программу построения, обработки, анализа кривых флюоресценции и ведения документации для метода ПЦР в режиме реального времени – Mx3000P (Stratagene, США).

Качество клинических образцов (качество забора, транспортировки, хранения, выделения) определяли по количеству геномной ДНК (β-глобинового гена человека). Для достижения чувствительности не менее чем 100 копий ДНК ВПЧ/10⁵ клеток человека введено ограничение на минимальное количество клеток человека в образце, которое составило 5,9 log (8,0 × 10⁵) копий ДНК человека/мл. В соответствии с полученными данными все образцы, содержащие менее 5,9 log ДНК человека/мл, считали невалид-ными [14].

Расчёт нормализованной вирусной нагрузки. Метод ПЦР в режиме реального времени, положенный нами в основу разработки методики количественного выявления HPV рода beta, позволяет определять абсолютное количество ДНК HPV и геномов человека в пробе. С учётом того, что при взятии клинического материала из очагов немеланоцитарных эпителиальных опухолей кожи или нормального эпителия кожи количество клеток и копий вируса, попадающих в исследуемый образец, может варьировать, мы использовали методику нормирования количества вируса на количество клеток человека, что является оправданным в отношении внутриклеточных инфекционных агентов. Подобный стандартизованный подход позволял получать надежные и достоверные данные о вирусной нагрузке при различных патологиях кожи [14].

Расчёт нормализованной вирусной нагрузки производили по формуле:

ВН = log [(кол-во ДНК HPV / кол-во ДНК чел)] × 10⁵,

где ВН – нормализованная вирусная нагрузка.

Проводили количественный и качественный анализ показателей вирусной нагрузки ДНК HPV во всех вирусположительных эпителиальных неоплазиях у пациентов основных групп.

Статистическая обработка данных. Статистическую значимость различия частоты определяли с помощью критерия χ². Доверительные границы к частоте рассчитывали на основании биномиального распределения. Для анализа характерных вирусных нагрузок рассчитывали десятичный логарифм количества вирусов, анализ его связи с другими переменными проводили с использованием метода параметрической статистики: статистическую значимость различий средних по группам вычисляли с помощью дисперсионного анализа, а доверительные границы к среднему – на основе распределения Стьюдента.

Методику определения фототипов кожи проводили в соответствии со шкалой Фицпатрика [14]. По степени чувствительности человека к UV-лучам различают шесть конституциональных фототипов кожи. Клинически выделяют четыре стадии фотостарения кожи (по Р. Глогау) [14]:

I стадия развивается в возрасте 20–30 лет и характеризуется минимальными признаками фотостарения: умеренные нарушения пигментации, минимально выражены мимические морщины;

II стадия – в возрасте 30–40 лет, характеризуется умеренными признаками фотостарения: желтоватый оттенок кожи, наличие пальпируемых очагов гиперкератоза, заметны мимические морщины, умеренное количество элементов лентиго на открытых участках кожного покрова;

III стадия наблюдается после 40 лет и характеризуется выраженными признаками фотостарения: статические морщины, дисхромия, телеангиэктазии, выраженный кератоз, прогрессирующий солнечный эластоз на открытых участках кожного покрова;

IV стадия развивается обычно после 60 лет, характеризуется «катастрофическими», или необратимыми, признаками фотостарения: выраженный солнечный эластоз, множественное лентиго на всех участках кожного покрова, статические морщины на всей поверхности кожи, желтовато-пепельный оттенок кожи, множественные очаги кератоза, доброкачественные и злокачественные новообразования [14].

Результаты и обсуждение

При анализе структуры фототипов у 80 пациентов, вошедших в исследование, мы установили, что бóльшая часть из них (59; 73,75 %) имела II фототип кожи по Фицпатрику, 12 (15%) – I фототип, 9 (11,25%) – III фототип (рис. 2).

 

Рис. 2. Анализ структуры основных фототипов 80 пациентов.

 

Процессу фотостарения кожи с высоким риском развития новообразований наиболее подвержены именно люди с I, II мелано-дефицитным и III мелано-компетентным типом конституциональной чувствительности [14].

Клиническая оценка выраженности стадий фотостарения (дерматогелиоза) (адаптированная шкала SCINEXA)

Для проведения клинической оценки степени выраженности дерматогелиоза была использована адаптированная шкала SCINEXA (табл. 2).

 

Таблица 2. Клинические признаки фотостарения (дерматогелиоза), оцениваемые по адаптированной шкале SCINEXA

Признак	Локализация	Количество баллов
Признаки, характеризующие хронологическое старение кожи
Неравномерная пигментация	Закрытые участки кожного покрова	0/3
Тонкие морщины	Закрытые участки кожного покрова	0/1/2/3
Провисание кожи	Закрытые участки кожного покрова	0/1/2/3
Уменьшение объёма жировой ткани	Закрытые участки кожного покрова	0/1/2/3
Доброкачественные новообразования (гемангиомы, себорейный кератоз)	Закрытые участки кожного покрова	0/1/2/3
Признаки, характеризующие индуцированное UV-облучением старение кожи
Нарушение пигментации (веснушки после солнечных ожогов)	Плечи, область верхнего плечевого пояса	0/1/2/3
Солнечное лентиго	Задняя поверхность предплечий	0/1/2/3
Диспигментация	Открытые участки кожи, шея, лицо	0/1/2/3
Желтоватый цвет кожи	Открытые участки кожи, лицо	0/1/2/3
Псевдорубцы	Открытые участки кожи	0/1/2/3
Грубые морщины	Лицо	0/1/2/3
Лимонная кожа Миллиана	Лицо	0/1/2/3
Ромбовидная кожа шеи	Шея	0/3
Болезнь Фавра–Ракушо	Лицо	0/3
Ксероз кожи	Лицо, задняя поверхность предплечий	0/1/2/3
Комедоны	Периорбитальная область	0/1/2/3
Телеангиэктазии	Щёки, нос	0/1/2/3
Перманентная эритема	Щёки, нос	0/1/2/3
Актинический кератоз	Открытые участки кожи, лицо	0/3
Базально-клеточный рак кожи	Открытые участки кожи, лицо	0/3
Плоскоклеточный рак кожи	Открытые участки кожи, лицо	0/3
Меланома	Открытые участки кожи, лицо	0/3

При анализе данных, представленных в табл. 3 и наглядно отражённых на рис. 3, становится очевидно, что максимальное количество баллов степени фотостарения кожи отмечено у пациентов, входящих в 1-ю группу, – 35,02 ± 0,56 (что соответствует IV степени фотоповреждений по Глогау – «катастрофической») (рис. 4) и значительно превышает таковой показатель степени фотостарения во 2-й группе пациентов – 18,8 ± 1,33 (что соответствует I степени дерматогелиоза по Глогау – умеренной) (рис. 5, 6) и в 2 раза превышен по сравнению с группой контроля – 15,7 ± 1,15 баллов, несмотря на то, что средний возраст пациентов данных групп достоверно не отличался.

 

Рис. 3. Степень выраженности фотостарения (дерматогелиоза) с использованием модифицированной шкалы SCINEXA в 1-й, 2-й и контрольной группах, в баллах.

 

Рис. 4. Пациентка 1-й группы. Диагноз: дерматогелиоз IV степени. I фототип, солнечный эластоз множественные базально-клеточные папилломы, лентиго, гипертрофический актинический кератоз, базально-клеточная карцинома кожи левого виска и левого ската носа.

 

Рис. 5. Пациент 2-й группы. Диагноз: дерматогелиоз IV степени, II фототип, множественные гигантские базально-клеточные папилломы на коже верхних конечностей.

 

Рис. 6. Пациентка 2-й группы. Диагноз: дерматогелиоз II степени, III фототип. а – множественные базально-клеточные (себорейные) кератомы, фиброэпителиальные полипы кожи живота; б – фиброэпителиальный полип кожи живота (фрагмент).

 

Таблица 3. Степень выраженности фотостарения (дерматогелиоза) с использованием модифицированной шкалы SCINEXA

Показатель	группа
	1-я	2-я	контрольная
Возраст, лет	46,5 ± 6,5	51,0 ± 5,6	50,0 ± 5,1
Степень дерматогелиоза, балл	35,02 ± 0,56	18,8 ± 1,33	15,7 ± 1,15

 

Анализ спектра клинических проявлений в анализируемых группах пациентов

У всех 80 анализируемых нами пациентов диагностированы эпителиальные неоплазии кожи разной степени агрессивности. Так, доброкачественные неоплазии кожи были представлены солнечным кератозом (Кс) у 18 пациентов, типичной кератоакантомой (Ка) у 5, аденомой сальных желёз (Ас) у 21, фиброэпителиальными полипами (Фп) у 22, базально-клеточными папилломами (Бп) у 27, вульгарными бородавками (Вб) у 15. Предраковые неоплазии были представлены 15 очагами актинического кератоза (Ак) и 3 очагами болезни Боуэна (ББ). Среди злокачественных неоплазий наблюдались базально-клеточные карциномы (Бк) у 30 пациентов и атипичные кератоакантомы (Ак) у 10 (табл. 4). Однако характер, степень агрессивности и количество немеланоцитарных эпителиальных опухолей кожи значительно варьировали в 1-й и 2-й группах пациентов.

При клинико-морфологическом мониторинге спектра эпителиальных неоплазий пациентов 1-й группы обращает на себя внимание преобладание множественного характера поражения кожи и наличие сочетаний доброкачественных и предраковых неоплазий со злокачественными немеланоцитарными эпителиальными опухолями кожи. Кроме того, преобладающее количество очагов эпителиальных неоплазий у этих пациентов располагается на открытых участках кожного покрова (лицо, шея, зона декольте, верхняя часть спины и верхние конечности). У 33 (78,5%) из 42 пациентов 1-й группы выявлено наибольшее число случаев сочетания множественных очагов доброкачественных и злокачественных немеланоцитарных эпителиальных опухолей кожи на фоне выраженных клинических признаков фотостарения (соответствующих IV степени по Глогау). У 17 пациентов мы выявили сочетание множественных базально-клеточных папиллом, лентиго, фиброэпителиальных полипов, кератоза солнечного и актинического с базально-клеточной карциномой (рис. 7, 8), у 13 – сочетание множественных базально-клеточных папиллом, аденом сальных желёз, лентиго, солнечного эластоза, фиброэпителиальных полипов с гипертрофической формой актинического кератоза (предраковый дерматоз) (рис. 9), у 3 – сочетание множественных базально-клеточных папиллом, аденом сальных желёз с болезнью Боуэна.

 

Рис. 7. Пациент 1-й группы. Диагноз: дерматогелиоз IVстепени, II фототип, солнечный эластоз, множественные базально-клеточные папилломы, фиброэпителиальные полипы, гипертрофический актинический кератоз, множественные базально-клеточные карциномы кожи спины.

 

Рис. 8. Пациент 1-й группы. Диагноз: дерматогелиоз IV степени, II фототип, солнечный эластоз, множественные базально-клеточные папилломы, фиброэпителиальные полипы, гипертрофический актинический кератоз, базально-клеточная карцинома периорбитальной зоны.

 

Рис. 9. Пациент 1-й группы. Диагноз: дерматогелиоз IV степени, II фототип, солнечный эластоз, плоские бородавки, аденомы сальных желёз, множественные гигантские базально-клеточные папилломы, фиброэпителиальные полипы, актинический кератоз.

 

У остальных 9 пациентов 1-й группы отмечалось наличие множественных очагов базально-клеточных папиллом, базально-клеточных карцином на фоне выраженных признаков фотостарения, отличающихся большими размерами и выраженной тенденцией к преобладанию эрозивно-язвенных вариантов течения (рис. 10, а, б).

 

Рис. 10. Пациент 1-й группы. Диагноз: дерматогелиоз IV степени, II фототип: а – солнечный эластоз, множественные гигантские базально-клеточные папилломы, фиброэпителиальные полипы, актинический кератоз, базально-клеточная карцинома правого ската носа; б – базально-клеточная карцинома правого ската носа (фрагмент).

 

Таблица 4. Распределение пациентов по нозологическим формам немеланоцитарных эпителиальных опухолей кожи и количеству исследованных опухолевых очагов

Группа новообразований	Нозологическая форма немеланоцитарных эпителиальных опухолей кожи	Число пациентов	Количество исследованных опухолевых очагов
Доброкачественные опухоли кожи	Базально-клеточные папилломы	8	27
	Фиброэпителиальные полипы	7	22
	Бородавки вульгарные	4	15
	Кератоакантома типичная	3	5
	Кератоз актинический	5	26
	Аденома сальных желёз	18	21
Предзлокачественные опухоли	Гипертрофический актинический кератоз	12	15
	Болезнь Боуэна	3	3
Злокачественные опухоли кожи	Базально-клеточная карцинома	15	30
	Атипичная кератоакантома	3	10
Нормальная кожа		40	40
Всего		120	196

 

При клинико-морфологическом мониторинге спектра эпителиальных неоплазий у 38 пациентов 2-й группы без клинических признаков фотостарения нами выявлено, что в большинстве случаев очаги немеланоцитарных эпителиальных опухолей кожи носили солитарный характер и относились к спектру доброкачественных. Так, только у 18 пациентов обнаружилось сочетание солитарных очагов различных доброкачественных неоплазий у одного больного, из них у 15 выявлено сочетание базально-клеточных папиллом, кератом и фиброэпителиальных полипов, в 3 случаях – сочетание солитарных очагов аденомы сальных желёз, актинического кератоза, вульгарных и плоских бородавок. В остальных 20 случаях очаги доброкачественных немеланоцитарных эпителиальных опухолей кожи были солитарными: у 15 пациентов – аденомы сальных желёз, у 3 – базально-клеточные папилломы, у 2 – вульгарные и плоские бородавки.

Молекулярно-генетическая детекция вирусов папилломы человека в образцах кожи пациентов

Молекулярно-генетическая детекция ДНК HPV рода beta проводилась в 196 образцах. Последовательности ДНК HPV рода beta выявлены в 53,8% случаев базально-клеточных папиллом, в 20% типичных кератоакантом, в 94,4% гипертрофического актинического кератоза, в 66,6% болезни Боуэна, в 83,3% базально-клеточных карцином, в 80% атипичных кератоакантом с признаками атипии. Наряду с этим HPV рода beta обнаруживали и в микробиоптатах нормальной кожи здоровых доноров, но в незначительных количествах – 32,5% (табл. 5).

Таким образом, при анализе полученных данных выявлены признаки интегративной вирогении папилломавирусной инфекцией кожного типа рода beta во всех исследуемых образцах в довольно высоком проценте случаев.

Кроме того, как в немеланоцитарных эпителиальных опухолях кожи, так и нормальной коже выявлялся весьма широкий спектр генотипов HPV рода beta, принадлежащих к различным видам (β1, β2, β3, β4, β5).

При анализе сравнительной частоты детекции генотипов HPV рода beta в исследуемых образцах 1-й группы иммуносупрессивных пациентов с IV степенью фотостарения папилломавирусы генотипов β1 и β2 встречались в 1,5–2 раза чаще, чем представители других (β3, β4, β5) видов (табл. 6). При этом отмечена приблизительно одинаковая частота детекции разных генотипов (β1, β2, β3, β4, β5) HPV рода beta в исследуемых образцах иммунокомпетентных пациентов 2-й группы с I степенью фотостарения (табл. 7).

 

Таблица 5. Количество HPV-позитивных и негативных образцов в эпителиальных опухолях и образцах нормальной кожи

Исследуемый образец	Количество образцов	Количество HPV-негативных образцов		Количество HPV-позитивных образцов
		абс.	%	абс.	%
Кератоз актинический	26	12	46	14	53,8
Базально-клеточные папилломы	27	–	–	27	100
Фиброэпителиальные полипы	7	3	42,8	4	57,2
Аденома сальных желёз	18	13	72,2	15	83,3
Вульгарные бородавки	15	–	–	15	100
Кератоакантома	5	4	80	1	20
Гипертрофический актинический кератоз	18	1	5,6	17	94,4
Болезнь Боуэна	3	1	33,3	2	66,6
Базально-клеточная карцинома	30	5	16,6	25	83,3
Атипичная кератоакантома	10	2	20	8	80
Нормальная кожа (контроль)	40	27	67,5	13	32,5
Всего...	199	58	29,15	141	70,85

 

Таблица 6. Сравнительная частота детекции генотипов HPV рода beta в исследуемых образцах иммуносупрессивных пациентов 1-й группы с IV степенью фотостарения и нормальной кожи (контроль)

Исследуемый образец иммуносупрессивных пациентов 1-й группы с фотостарением IV степени	Количество HPV-позитивных образцов	Спектр генотипов HPV рода beta
		beta 1*		beta 2*		beta 3*		beta 4, 5*
		абс.	%	абс.	%	абс.	%	абс.	%
Кератоз актинический	7	7	100	6	85,7	5	71,4	6	85,6
Кератоакантома атипичная	8	8	100	8	100	4	50	3	37,5
Гипертрофический актинический кератоз	17	12	70,5	17	100	7	41,1	5	29,4
Базально-клеточная карцинома	25	24	96	23	92	11	44	6	24
Болезнь Боуэна	2	1	50	2	100	–	–	–	–
Нормальная кожа	13	3	23	4	30,7	9	69,2	5	38,4

Примечание. Здесь и в табл. 7: * – в том числе в ассоциации с другими видами.

 

Таблица 7. Сравнительная частота детекции генотипов HPV рода beta в исследуемых образцах иммунокомпетентных пациентов 2-й группы (без признаков дерматогелиоза) и нормальной кожи (контроль)

Исследуемый образец иммунокомпетентных пациентов 2-й группы без признаков фотостарения	Количество HPV-позитивных образцов	Спектр генотипов HPV рода beta
		beta 1*		beta 2*		beta 3*		beta 4, 5*
		абс.	%	абс.	%	абс.	%	абс.	%
Кератоз актинический	7	7	100	6	85,7	5	71,4	6	85,7
Базально-клеточные папилломы	27	27	100	25	92,5	21	77,7	23	85,1
Фиброэпителиальные полипы	4	3	75	4	100	2	50	1	25
Аденома сальных желёз	15	14	93,3	13	86,6	9	60	14	93,3
Вульгарные бородавки	15	7	46,6	15	100	–	–	9	60
Кератоакантома типичная	1	1	100	1	100	–	–	1	100
Нормальная кожа	13	3	23	4	30,7	9	69,2	5	38,4

 

При изучении вируспозитивных (немеланоцитарные эпителиальные опухоли) образцов кожи пациентов 1-й группы с фотостарением IV степени и клинической картиной доброкачественных, предраковых и злокачественных новообразований нами выявлена интегративная вирогения в виде ассоциации двух и более видов вирусов рода beta (71,4–100% случаев). При изучении вируспозитивных образцов здоровой кожи лиц контрольной группы наблюдалось инфицирование только одним видом HPV рода beta в 85,7% образцов (р < 0,01) (табл. 8).

 

Таблица 8. Встречаемость одного или нескольких генотипов HPV рода beta в образцах эпителиальных опухолей и нормальной кожи

Исследуемый образец	Количество HPV-позитивных образцов	Детекция HPV в образце
		одного генотипа		двух и более генотипов
		абс.	%	абс.	%
Актинический кератоз	14	4	28,6	10	71,4
Кератоакантома атипичная	8	2	25	6	75
Болезнь Боуэна	2	–	–	2	100
Гипертрофический актинический кератоз	17	–	–	17	100
Базально-клеточная карцинома	30	3	10	27	90
Нормальная кожа (контроль)	13	9	69,2	4	30,8

 

Количественный анализ показателей вирусной нагрузки ДНК HPV во всех вируспозитивных эпителиальных неоплазиях

В результате проведённого количественного анализа установлено, что средние показатели вирусной нагрузки ДНК HPV во всех вируспозитивных эпителиальных неоплазиях у пациентов 1-й группы значительно превышали средние показатели вирусной нагрузки ДНК вируса в нормальной коже (1,4 ± 0,6 log на 10⁴ клеток), при этом в образцах себорейных кератом вирусная нагрузка составляла 2,3 ± 0,6 log на 10⁴ клеток, в образцах аденом сальных желез – 3,7 ± 0,9 log на 10⁴ клеток, актинического кератоза – 4,05 ± 0,2 log на 10⁴ клеток, карцином базально-клеточных – 2,08 ± 1,4 log на 10⁴ клеток; различия имели статистически значимый характер (р < 0,05).

Таким образом, количественное измерение ДНК вируса позволяет более точно судить о характере присутствия вируса в опухолевой ткани и может рассматриваться наиболее предпочтительным методом для изучения связи вируса с развитием, течением или прогрессированием заболевания.

Увеличение вирусной нагрузки в образцах эпителиальных неоплазий кожи у пациентов с катастрофической стадией фотостарения по сравнению с нормальной кожей указывает на активацию папилломавирусной инфекции и может, на наш взгляд, являться подтверждением наиболее вероятной гипотезы влияния HPV кожного типа, в которой они рассматриваются кофактором промоции опухолевого роста клеток, уже повреждённых опухольинициирующим эпигенетическим фактором – результатом кумулятивного эффекта UV-излучения, т.е. фотостарением. Возможно, папилломавирусную инфекцию следует рассматривать с позиций коканцерогенеза с прогрессирующим дерматогелиозом, на что косвенно указывают как преимущественная локализация элементов на открытых участках кожи, так и высокие риски их злокачественного перерождения. Полученные нами данные связаны с различным уровнем кумулятивного воздействия UV-излучения на кожу в течение жизни пациентов, который определяет степень фотостарения и провоцирует развитие предраковых и злокачественных эпителиальных опухолей кожи, таких как актинический кератоз, базально-клеточная карцинома и атипичная кератоакантома.

Нами продемонстрировано, что выявленные у больных 1-й группы с дерматогелиозом (показатель степени по шкале SCINEXA 35,02 ± 0,56) и множественными эпителиальными неоплазиями (базально-клеточными папилломами, фиброэпителиомами, кератомами, карциномами кожи) высокие показатели детекции папилломавирусов в пролиферирующей ткани (2,3 ± 0,6 log на 10⁴ клеток), аденомах сальных желёз (3,7 ± 0,9 log на 10⁴ клеток), актиническом кератозе (4,05 ± 0,2 log на 10⁴ клеток) значительно превышают показатели вирусной нагрузки ДНК вируса в нормальной коже (1,42 ± 0,6 log) и коррелируют с другими клинико-анамнестическими признаками, в частности выраженными признаками дерматогелиоза по Глогау (IV катастрофическая стадия) и конституционально высокой степенью фоточувствительности (II–III по Фицпатрику), что свидетельствует о формировании «патологического тандема», который составляет местная иммуносупрессия и множественные пролиферативные очаги эпидермиса.

На основании полученных данных мы проанализировали зависимость вирусной нагрузки ДНК HPV в образцах кожи с немеланоцитарными эпителиальными неоплазиями кожи различной степени агрессивности (фиброэпителиальные полипы, базально-клеточные папилломы, кератозы, солнечный эластоз, аденомы, карциномы) с целью определения степени вероятности развития злокачественных эпителиальных новообразований кожи, исходя из показателей нормальной вирусной нагрузки ДНК HPV в здоровой коже.

Таким образом, учитывая полученные статистически значимые данные, мы вывели индекс рисков развития злокачественных эпителиальных немеланоцитарных новообразований кожи К и ввели градации уровня риска – низкий, средний, высокий.

Индекс рисков развития злокачественных эпителиальных немеланоцитарных новообразований кожи К рассчитывается по формуле:

К = ВН / ВНn,

где ВН – показатель вирусной нагрузки, ВНn = 1,42 ± 0,6 – показатель вирусной нагрузки в здоровой коже.

Учитывая введённые градации уровней рисков, можно рассчитать, что низкий уровень рисков развития злокачественных немеланоцитарных эпителиальных новообразований соответствует индексу К1, при котором показатель вирусной нагрузки составляет менее 1,68:

К1 = ВН1 / ВНn ≤ 1,68.

Средний уровень рисков развития злокачественных немеланоцитарных эпителиальных новообразований соответствует индексу К2, при котором показатель вирусной нагрузки составляет 1,7–1,9:

К2 = ВН2 / ВНn ≤ 1,7–1,9.

Высокий уровень рисков развития злокачественных немеланоцитарных эпителиальных новообразований соответствует индексу К3, при котором показатель вирусной нагрузки равен или превышает показатель 2,0:

К3 = ВН3 / ВНn ≥ 2,0.

Таким образом, при наличии индекса К3 (2,0 и более) существует высокий риск развития злокачественного потенциала в эпителиоцитах, что приводит к развитию злокачественных опухолей кожи, в частности базально-клеточных карцином. При наличии индекса К2 (1,9–2,0) следует рекомендовать регулярные контрольные осмотры кожного покрова пациентов, дерматоскопическое исследование в динамике и регулярное применение фотопротекторных средств с целью профилактики негативного воздействия солнечного излучения.

About the authors

Elena S. Snarskaya

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, (Sechenov University)

Author for correspondence.
Email: snarskaya-doc@mail.ru

MD, PhD, DSc., professor of the Department of skin and venereal diseases of I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Russian Federation, Moscow, 119991

Awad Z. Zhaber

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: snarskaya-dok@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

References

Supplementary files