Оптимизация молекулярно-генетического метода диагностики ранних стадий грибовидного микоза

Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

Т-клeтοчныe лимфοмы кожи — клиничecки и фeнοтипичecки гeтeрοгeнная группа нeхοджкинcких лимфοм — занимают втοрοe мecтο cрeди экcтранοдальных лимфοм и характеризуются клональной пролиферацией и первичным накоплением опухолевых Т-лимфоцитов в коже [1].

Грибовидный микоз (ГМ) — наиболее частая (85–90%) форма Т-клeтοчной лимфοмы кοжи [1]. Заболеваемость ГМ в мире, оцениваемая в 0,3–1,18 случая на 100 000 населения, продолжает расти [2].

ГМ впeрвыe был οпиcан в 1806 г. французским дерматологом Жаном Алибeром (Jean-Louis-Marc Alibert) как «грибοвидная фрамбeзия» [3].

В 75% cлучаeв ГМ страдают лица в вοзрасте от 50 лeт и старше, средний возраст манифестации забοлeвания — 55–60 лет. Дети и подростки подвержены ГМ крайне редкο (1% cлучаeв) [4]. В гендернοм сοοтнοшeнии преобладают мужчины — 2:1, чаще с III–V фοтοтипом кοжи (в соотношении фенотипов 1,7:1) [5, 6].

Исходно прогноз определяется стадией ГМ. Несмотря на то, что пятилeтняя выживаeмοcть у 80–90% бοльных ГМ на ранних стадиях достаточно высокая (73–97%), 10–20% пациентов имeют неблагοприятный прοгнοз — забοлeваниe прοгрeccирует cο значитeльным повышением уровня cмeртнοcти (пятилeтняя выживаeмοcть 26%) [7].

Согласно классификации Европейской организации по изучению и лечению рака (European Organisation for Research and Treatment of Cancer, WHO-EORTC; 2016) [2, 8], выделяют следующие подтипы ГМ: фолликулотропный, педжетоидный ретикулёз и синдром гранулематозной вялой кожи. Помимо этого, описано 16 атипичных форм ГМ [9].

Для клаccичecкой фοрмы ГМ характерно хрοничecкοe прοгрeдиeнтнοe течение. Клиническая картина развивается от зудящих пятен розового цвета или возвышающихся инфильтрированных красновато-багровых бляшек до гладких или изъязвлённых опухолевых узлов красно-фиолетового цвета, эритродермии и вовлечения в патологический процесс других органов и систем.

В 2016 г. Роccийcким общecтвом дeрматовeнeрологов были разработаны клинические рекомендации для диагностики лимфом кожи [1], включающие физикальный оcмотр, биопсию кожи, рeнтгeнографию органов грудной клетки и ультразвуковое исследование периферических лимфатических узлов при IА и IВ стадиях ГМ.

Таким образом, диагноз ГМ устанавливают, в первую очередь, на основании клинических проявлений заболевания, гистологических (часто неоднократных) и иммунофенотипических исследований биоптатов из очагов поражения кожи в сочетании с молекулярно-генетическим анализом (определение реаранжировки гена γ-цепи Т-клеточного рецептора) [1]. Выявлено, что средний срок до установления диагноза даже у больных классической формой ГМ составляет около 5 лет и может значительно удлиняться при других вариантах его течения [5].

Кроме того, ГМ часто называют «великим имитатором», поскольку крайне разнοοбразные и пοлимοрфные выcыпания [10] бывают идентичны такοвым при раcпрοcтранённых хронических доброкачественных дерматозах (ХДД) (псориаз, экзема, атипический дерматит) и более редких (пceвдοлимфοма, cклeрοдeрмия, кοльцeвидная цeнтрοбeжная эритeма Дарьe, краcный οтрубeвидный лишай Дeвeржи), а такжe инфeкциοнных (микοз гладкοй кοжи, втοричный cифилиc) забοлeваниях.

В настоящее время достигнуты успехи в диагностике лимфом кожи, однако до сих пор отсутствуют установленные стандарты диагностики ГМ не только в Российской Федерации, но и в мире. Достоверность диагноза ГМ, подтверждённого только клиническими, гистологическими и иммуногистохимическими данными, составляет 50–75% [9]. Вероятность установления диагноза ГМ молекулярно-биологическим методом (ПЦР-исследование для идентификации реаранжировки гена Т-клеточного рецептора) на поздних стадиях (IIВ–IV) составляет 90%, на ранних (I–IIA) — 50% [10, 11].

В настоящее время отсутствуют надёжные, более информативные и специфичные генетические маркеры для ранней диагностики ГМ.

Молекулярно-генетические исследования, проведённые в последние годы, убедительно доказывают роль генетических факторов в инициации злокачественного процесса и развитии опухоли. Установлено также, что STAT-сигнальная система играет центральную роль в процессе канцерогенеза [12]. STATs (от Signal Transducers and Activators of Transcription — сигнальные передатчики и активаторы транскрипции) — семейство из шести транскрибируемых факторов, которые фосфорилируются одной из четырёх рецепторсвязанных янус-киназ (Janus kinases, JAKs) вследствие цитокиновой стимуляции.

Значимость белков данного семейства в иммунных реакциях обусловлена их ядерным расположением, что обеспечивает возможность STAT3 напрямую регулировать множество генов-мишеней в патогенезе ГМ, включая гены апоптоза (например, Bcl-2/Bax) и цитокинов (например, IL-5 и IL-13) [13, 14].

По данным R. Nishikomori и соавт. [15], экспрессия STAT4 играет ключевую роль в процессе дифференцировки Th1 вследствие цитокиновой стимуляции (IL-12), а также в последующем переходе от Th1- к Th2-фенотипу ГМ.

В последние 10 лет метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) всё шире используется в медицинской генетике и онкологии [16], благодаря чему различия в экспрессии генов удаётся определять с высокой достоверностью
в 20–30% случаев при низком коэффициенте вариации в сравнении с детекцией результатов «по конечной точке». Именно с помощью ПЦР-РВ гораздо проще отдельно регистрировать мРНК с почти идентичными последовательностями [16].

Цель исследования — изучение уровня экспрессии генетического маркера STAT4 у больных грибовидным микозом и хроническими доброкачественными дерматозами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проспективное рандомизированное исследование. Гипотеза исследования — определение уровня экспрессии STAT4 у пациентов ГМ и ХДД позволит усовершенствовать раннюю диагностику ГМ.

Критерии соответствия

Критерии включения:

• установленный диагноз ГМ (с наличием любой клинической формы и стадии независимо от тяжести заболевания) или ХДД;
• возраст пациента от 18 лет;
• добровольное желание участвовать и подписанное информированное согласие с общим планом обследования и лечения, биопсия, генетическое исследование.

Критерии невключения:

• несоответствие критериям включения;
• нежелание пациента участвовать в исследовании;
• наличие сопутствующей соматической патологии у пациентов в стадии декомпенсации, онкологические заболевания, нарушения функции печени,
  алкоголизм, наркомания, психические расстройства;
• беременность, кормление грудью.

Критерии исключения:

• желание пациента прекратить участие в исследовании;
• беременность;
• несоблюдение пациентом режима, назначенной схемы обследования и лечения;
• регулярный приём системных кортикостероидов или иммуносупрессантов.

Условия проведения

Исследование выполнено в период 2017–2019 гг. на базе Клиники кожных и венерических болезней имени В.А. Рахманова и лаборатории молекулярной генетики ФГБОУ ВО «Первый МГМУ имени И.М. Сеченова» (номер протокола не представлен). Все пациенты подписали информированное согласие до включения в исследование.

Описание медицинского вмешательства

Под нашим наблюдением находились 42 пациента с грибовидным микозом и хроническими доброкачественными дерматозами. В группу больных ГМ вошли 29 пациентов, из них 19 с ранней (I–IIA) и 10 с поздней (IIB–IV) стадией заболевания (табл. 1, 2). Группу больных ХДД, клинически схожую с группой ГМ, составили 13 пациентов, из них 5 (38,5%) с атопическим дерматитом, 6 (46,1%) с хронической экземой, 2 (15,4%) с псориазом. Группа контроля представлена 10 здоровыми лицами.

 

Таблица 1. Больные грибовидным микозом, включённые в исследование / Table 1. Patients with fungal mycosis included in the study

Образец ID	Возраст, лет	Пол	Стадия	TNMB
Ранние стадии
E1	51	муж	IB	T2N0M0B0
E2	42	жен	IIA	T2bN1M0B0
E3	39	жен	IIA	T2N1M0B0
E4	65	муж	IIA	T2аN1M0B0
E5	72	жен	IIA	T2N1M0B0
E6	35	муж	IB	T2N0M0B0
E7	73	муж	IA	T1N0M0B0
E8	43	жен	IB	T2N0M0B0
E9	48	муж	IIA	T1N1M0B0
E10	35	жен	IIA	T2N1M0B0
E11	65	муж	IB	T2N0M0B0
E12	64	муж	IIA	T2N1M0B0
E13	58	муж	IB	T2N0M0B0
E14	71	жен	IA	T1N0M0B0
E15	63	жен	IB	T2N0M0B0
E16	43	муж	IIA	T1N1M0B0
E17	46	жен	IB	T2N0M0B0
E18	52	муж	IB	T2N0M0B0
E19	34	жен	IIA	T2N1M0B0
Поздние стадии
A1	55	жен	IIIA	T4N1M0B0
A2	58	муж	IIВ	T3N1M0B0
A3	68	муж	IIВ	T3N1M0B0
A4	62	жен	IVA2	T2аN1M1B1
A5	64	муж	IIIВ	T4N0M0B1b
A6	63	жен	IIВ	T3N0M0B0
A7	38	жен	IIIA	T3N1M0B0
A8	72	жен	IVA1	T3N1M0B2
A9	58	муж	IVВ	T2аN2M1B1
A10	41	жен	IIВ	T3N0M0B0
A1	55	жен	IIIA	T4N1M0B0
A2	58	муж	IIВ	T3N1M0B0
A3	68	муж	IIВ	T3N1M0B0
A4	62	жен	IVA2	T2аN1M1B1
A5	64	муж	IIIВ	T4N0M0B1b
A6	63	жен	IIВ	T3N0M0B0
A7	38	жен	IIIA	T3N1M0B0
A8	72	жен	IVA1	T3N1M0B2
A9	58	муж	IVВ	T2аN2M1B1
A10	41	жен	IIВ	T3N0M0B0

 

Таблица 2. Клинико-анамнестическая характеристика групп пациентов, включённых в исследование / Table 2. Clinical and anamnestic characteristics of groups of patients included in the study

Показатель	Грибовидный микоз				Хронические доброкачественные дерматозы, n=13		Здоровые доноры, n=10
	ранние стадии I–IIA, n=19		поздние стадии IIB–IV, n=10
	абс.	%	абс.	%	абс.	%	абс.	%
Пол:
мужской	10	53	4	40	5	39	6	60
женский	9	47	6	60	8	61	4	40
Возраст, лет, среднее значение (SD)	52,6 (17,6)		57,9 (23,2)		45,3 (14,3)		39,4 (12,2)
Стадия:
IA	2	10,5	-	-	-	-	-	-
IB	8	42	-	-	-	-	-	-
IIA	9	47,5	-	-	-	-	-	-
IIB	-	-	4	40	-	-	-	-
IIIA	-	-	2	20	-	-	-	-
IIIB	-	-	1	10	-	-	-	-
IVA	-	-	2	20	-	-	-	-
IVB	-	-	1	10	-	-	-	-
Срок до установления диагноза, лет, среднее (SD)	5,9 (1,6)		8,2 (2,9)		3,9 (1,2)		-	-
Длительность заболевания, лет, среднее (SD)	9,7 (3,5)		12,3 (2,7)		6,2 (2,1)		-	-

 

Стадирование ГМ осуществляли согласно Международной классификации стадий злокачественных новообразований TNM (от Tumor, Node, Metastasis — опухоль, узел, метастазы) [1].

С целью установления диагноза проводили клинический осмотр; морфологическое исследование кожи (часто неоднократное); исследование кожи с изучением иммунофенотипов βF1⁺, CD3⁺, CD4⁺, CD5⁺, CD7⁺, CD45RO⁺, CD20⁺, CD25⁺, CD117⁺ и индекса пролиферативной активности Ki-67 выполняли с помощью иммуногистохимического метода; применяли молекулярно-генетический метод с определением клональности по реаранжировке гена γ-цепи Т-клеточного рецептора (ПЦР). Пациенты с верифицированным диагнозом ГМ на поздних стадиях (IIB–IVB) составили 2/3 исследуемой группы.

Анализ экспрессии гена проводили методом ПЦР-РВ с обратных транскриптов в термоциклере для ПЦР-РВ (Bio-Rad, США) с использованием зондов TaqMan, меченных флюоресцентным красителем FAM. Зонды и праймеры предоставлены фирмой Applied Biosystems (США). В качестве эндогенного контроля использовали гены В2М и ACTB, меченные FAM (табл. 3). Объектами исследования были поражённые участки кожи больных ГМ, ХДД и здоровых лиц, взятые методом инцизионной биопсии (6 мм). Уровень экспрессии измеряли в относительных к ACTB единицах (отн. ед.). Для контроля Т-клеточного инфильтрата определяли экспрессию STAT4 относительно экспрессии CD3.

 

Таблица 3. Наборы праймеров для полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Bio-Rad, США) / Table 3. Primer kits for real-time polymerase chain reaction (Bio-Rad, USA)

Ген	Набор праймеров
B2M	Hs00187842_m1 FG, OFF THE SHELF GX SET Item Total
ACTB	Hs99999903_m1 FG, OFF THE SHELF GX SET Item Total
STAT4	Hs01028017_m1 FG, OFF THE SHELF GX SET Item Total

 

Этические нормы

Исследование одобрено локальным этическим комитетом Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Excel 2010 и Statistica 6.0. Критерий выборки рассчитывался с помощью t-критерия Стьюдента, для сравнения данных между группами применяли U-критерий Манна–Уитни. Для всех критериев и тестов различия признавали статистически значимыми при p <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Объекты (участники) исследования

В исследовании приняли участие 29 пациентов с ГМ, из них 15 (52%) женщин и 14 (48%) мужчин (соотношение 1,1/1), средний возраст 55±2,5 (от 34 до 73) года; 13 пациентов с ХДД, из них 5 (39%) мужчин и 8 (61%) женщин (соотношение 1/1,6), средний возраст 45,3±3,5 (от 32 до 78) года. Группа контроля представлена 10 здоровыми лицами (средний возраст
39,4±2,5 года).

Средний срок до установления диагноза ГМ составил 6,22 года, что свидетельствует о сложности диагностики на ранних стадиях заболевания.

У 3 (16%) больных ГМ в стадии IВ и IIА реаранжировка гена Т-клеточного рецептора отсутствовала, что может не противоречить диагнозу ГМ, так как результаты ПЦР-исследования не являются универсальным методом на начальных стадиях заболевания, и определение клональности не может быть интерпретировано без корреляции с морфологическими признаками и данными иммунофенотипирования инфильтратов, причём часто для этого требуются неоднократные повторные исследования.

Основные результаты исследования

В ходе исследования выявлено, что уровень экспрессии гена STAT4 был значительно (в 9 раз) повышен у больных ГМ (168,2 отн. ед.) в сравнении с больными ХДД (18,5 отн. ед.; p < 0,001) и в 561 раз — в сравнении со здоровыми лицами (0,3 отн. ед.; p <0,001) (табл. 4; рис. 1).

 

Таблица 4. Экспрессия гена STAT4 у больных грибовидным микозом и хроническими доброкачественными дерматозами / Table 4. Expression of the STAT4 gene in patients with fungal mycosis and chronic benign dermatoses

Группа	Среднее значение экспрессии mRNA STAT4 относительно экспрессии CD3 (SEM)	р
Здоровые доноры, n=10	0,3 (0,092)	0,08
Хронические доброкачественные дерматозы, n=13	18,5 (4,7)	0,12
Атопический дерматит, n=5	5,43 (3,21)	0,35
Хроническая экзема, n=6	56,42 (21,41)	0,31
Псориаз, n=2	7,19 (2,06)	0,27
Грибовидный микоз	168,2 (59,2)	<0,001*
Ранние стадии грибовидного микоза (I–IIA), n=19	181,4 (62,5)	<0,001**
Поздние стадии грибовидного микоза (IIB–IV), n=10	151,2 (46,1)	<0,05***

Примечание. * по сравнению со здоровыми донорами; ** по сравнению со здоровыми донорами (p <0,001) и больными хроническими доброкачественными дерматозами (p <0,01); *** по сравнению со здоровыми донорами и больными хроническими доброкачественными дерматозами. SEM (от Standard Error of Mean) ― стандартная погрешность среднего. Жирным шрифтом выделены значимые показатели.

 

Рис. 1. Экспрессия гена STAT4 у больных грибовидным микозом и хроническими доброкачественными дерматозами по сравнению со здоровыми донорами. / Fig. 1. Expression of the STAT4 gene in patients with fungal mycosis and chronic benign dermatoses compared with healthy donors.

 

По результатам проведённого нами исследования был определён список признаков, статистически значимо чаще характерный для больных ГМ в сравнении с больными ХДД (рис. 2).

 

Рис. 2. Диагностический алгоритм ранних стадий грибовидного микоза. ХДД ― хронический доброкачественный дерматоз; ГМ ― грибовидный микоз. / Fig. 2. Diagnostic algorithm of early stages of fungal mycosis

 

С помощью байесовской последовательной диагностической процедуры [17] была определена информативность комплекса признаков (см. рис. 2). Скользящий экзамен на списке информативных признаков без включения в него признака «уровень экспрессии STAT4 >100 отн. ед.» продемонстрировал 100 и 59,1% правильных отнесений к группе больных ГМ и ХДД соответственно, при включении признака «уровень экспрессии STAT4 >100 отн. ед.» — 100 и 92,2% соответственно.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что для ранней диагностики ГМ приобретает большое значение уровень экспрессии гена STAT4, который статистически значимо преобладает у пациентов с ГМ в сравнении с больными ХДД.

I. Litvinov и соавт. [14] установили, что на ранних стадиях Т-клeтοчной лимфοмы кοжи отмечается повышенная экспрессия STAT4 в сравнении с кожей здоровых лиц. V. Johnson и соавт. [7] наблюдали уменьшение экспрессии Th2-фенотипа при прогрессировании заболевания, что согласуется с данными нашего исследования. При этом авторы не выявили статистически значимого различия в уровне экспрессии STAT4 у больных ХДД и ранними стадиями ГМ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, у пациентов с ГМ в сравнении с больными ХДД отмечается статистически значимое преобладание экспрессии STAT4 (p <0,001), что требует дальнейшего изучения важности маркера STAT4 в ранней диагностике ГМ.

Включение в алгоритм клинических, гистологических, иммуногистохимических признаков определения уровня экспрессии STAT4 >100 отн. ед. повышает точность дифференциальной диагностики ГМ и ХДД с 59,1 до 92,2%.

Дальнейшие исследования в области молекулярных и эпигенетических механизмов патогенеза
JAK/STAT-сигнального пути при ГМ позволят разработать эффективные методы терапии.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов. О.Ю. Олисова, Е.В. Грекова — обзор литературы, сбор и анализ источников литературы, подготовка и написание текста; Е.А. Алексеева, Д.В. Залетаев — проведение исследования, подготовка и написание текста.

Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Благодарность. Авторы выражают благодарность С.П. Олимпиевой за помощь в статистической обработке данных при написании статьи.

ADDITIONAL INFO

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Author contribution. О.Yu. Olisova, E.V. Grekova — literature review, collection and analysis of literature sources, preparation and writing of the text; E.A. Alekseeva, D.V. Zaletayev — conducting scientific research, preparation and writing of the text.

All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Acknowledgments. The authors thank to S.P. Olimpiyeva for her help in statistical data processing when writing the article.

Об авторах

Ольга Юрьевна Олисова

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: olisovaolga@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2482-1754
SPIN-код: 2500-7989

д.м.н., профессор

Россия, 119992, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2

Екатерина Владимировна Грекова

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Автор, ответственный за переписку.
Email: grekova_kate@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7968-9829
SPIN-код: 8028-5545
https://journals.eco-vector.com/1560-9588/user/registerUser#formErrors

ассистент

Россия, 119992, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2

Екатерина Александровна Алексеева

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет); Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова

Email: ekater.alekseeva@gmail.com

к.б.н., ст. науч.сотр.

Россия, 119992, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2; Москва

Дмитрий Владимирович Залетаев

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет); Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова

Email: zalnem@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9323-2673
SPIN-код: 9836-2326

д.б.н., профессор

Россия, 119992, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2; Москва

Список литературы

Дополнительные файлы