Genodiagnosis of HPV beta DNA association with seborrheic keratosis in immunosuppressed and immunocompetent patients

Full Text

Эпителиальные опухоли кожи - одна из самых распространенных групп опухолей, отличающаяся значительным разнообразием. Изучение их этиологии и патогенеза представляет значительный интерес для оптимизации лечения и профилактики. Провоцировать развитие эпителиальных опухолей могут интенсивная инсоляция, химические канцерогены, определенную роль отводят наследственным и иммунологическим нарушениям [1]. В настоящее время в связи с достижениями в области молекулярной биологии предпринимаются попытки определения роли вируса папилломы человека (ВПЧ) рода beta в развитии отдельных вариантов эпителиальных опухолей кожи - плоскоклеточного и базально-клеточного рака, актинического кератоза, ке- ратоакантомы, себорейного кератоза (СК) [1-3]. Наличие ВПЧ рода beta в целом ряде эпителиальных опухолей может быть следствием как активной вирусной инфекции, так и независимой бессимптомной персистен- ции, характерной для факторов естественной резистентности [1-3]. Поэтому, помимо выявления ВПЧ рода beta, целесообразно проводить количественное измерение вирусной нагрузки, определение которой является сравнительно новым подходом не только в диагностике папилло- мавирусной инфекции, но и в ее мониторинге, лечении и профилактике [3]. Отсутствие в большинстве очагов транскрипционной активности и низкая вирусная нагрузка, сопоставимая с таковой в здоровой коже, противоречат предположению о роли ВПЧ в стимуляции опухолевого роста [1-3]. Тем не менее ряд популяционных исследований, молекулярные и патоморфологические данные подтверждают, что ВПЧ рода beta могут играть этиологическую роль в развитии эпителиальных опухолей [4-6]. Иммуносупрессия является важным кофактором развития большинства эпителиальных новообразований кожи [6-8]. Так, по данным литературы [3], отмечается, что формирование ВПЧ-ассоциированных бородавок, ороговевающих кожных опухолей, в том числе себорейных кератом и немела- ноцитарных видов рака кожи, значимо повышается после операций трансплантации внутренних органов (рис. 1). Себорейный кератоз (СК) является самой распространенной доброкачественной эпителиальной опухолью кожи неизвестной этиологии, и сегодня ВПЧ рассматривается как один из возможных этиологических факторов. Ассоциация ВПЧ с СК была подтверждена в ряде исследований. Так, было показано наличие ВПЧ рода beta в 42 (76%) из 55 биоптатов СК у реципиентов почечного трансплантата (РПТ) против 13 (27%) из 48 образцов здоровой кожи (p < 0,005) [8]. Наряду с этими результатами в ряде других работ с использованием менее чувствительных разновидностей полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК ВПЧ в СК обнаружить не удалось [9]. С учетом вышеизложенного изучение ассоциаций ВПЧ с различными формами эпителиальных образований кожи (доброкачественными, предраковыми и злокачественными) на основе современных молекулярных методик с целью количественного определения ДНК ВПЧ является актуальной задачей дерматоонкологии, решение которой будет способствовать дальнейшему пониманию взаимосвязей развития эпителиальных образований кожи с ВПЧ. Цель исследования - изучить ассоциацию СК с ВПЧ на основе количественного анализа ДНК ВПЧ. Задачи исследования: определить встречаемость ДНК ВПЧ рода beta в СК и видимо здоровой коже РПТ и иммунокомпе- тентных больных, а также изучить вирусную нагрузку ДНК ВПЧ рода beta в СК и видимо здоровой коже РПТ и иммунокомпетентных людей. Рис. 1. Множественные очаги себорейного кератоза, развившегося у пациентки после трансплантации почки. Материалы и методы Обследовано 60 больных с РПТ, находящихся на лечении в отделении хронического гемодиализа и трансплантации почки, длительно получающих курсы иммуносупрессивной терапии. У 20 пациентов, имеющих множественные элементы СК, был проведен забор материала (микробиоптат кожи) из очагов СК, а также взят образец здоровой кожи в области плеча. Аналогично обследованы 20 иммунокомпетентных больных с множественными проявлениями СК, не получавших иммуносупрессивную терапию. Группа иммуносупрессивных лиц состояла из 10 мужчин и 10 женщин в возрасте от 22 до 60 лет (средний возраст 46 ± 10 лет). Длительность иммуносупрессии составляла от полугода до 13,5 года (медиана 3 года). Иммуносупрессивную терапию 16 больным РПТ проводили микофенолата мофетилом, такроли- мусом и преднизолоном; 4 больных получали курсы циклоспорина А в комбинации с другими иммуносупрессивными препаратами. Группа иммунокомпетентных лиц с СК состояла из 10 мужчин и 10 женщин, в возрасте от 24 до 78 лет (средний возраст 43 ± 15 лет). Контрольная группа представлена 49 добровольцами, из них 29 мужчин и 20 женщин, в возрасте 39 ± 13 лет, у которых кожные заболевания, в том числе ассоциированные с кожными типами ВПЧ, отсутствовали. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ Statistica 10.0. Статистическую значимость различий частот определяли с помощью у2-критерия. Для проверки распределения на нормальность применяли критерий Шапиро-Уилка. При p > 0,05 нулевую гипотезу о нормальности распределения не отвергали. Для анализа характерных вирусных нагрузок рассчитывали десятичный логарифм количества вирусов. Сравнение несвязанных выборок осуществляли с использованием критерия Манна-Уитни, связанных - с помощью критерия Вилкоксона. Различия считали статистически значимыми прир < 0,05. Генодиагностику ВПЧ-инфекции проводили на базе ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора [3]. Материал забирали в стерильных условиях борами (микробиоптаты), помещали в пробирки с транспортной средой и хранили при температуре 70оС. Пробоподготовку проводили методом обработки ткани протеиназой К с последующим выделением методом аффинной сорбции на силикагеле. Определение ДНК ВПЧ рода beta в биоптатах осуществляли методом ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Амплификацию и детекцию проводили на приборе Rotor-Gene 3000 ("Corbett Research", Австралия). Для количественного определения ВПЧ рода beta, а также для оценки ее чувствительности и специфичности, использовали рекомбинантные плазмидные положительные контроли, содержащие последовательность полных геномов ВПЧ кожных типов рода альфа, гамма, ми, ни и бета и контрольные плазмиды фрагмента Р-глобинового гена человека. Для выявления ДНК ВПЧ рода beta использовали четыре системы олигонуклеотидов (группоспецифических праймеров и зондов): 3. 4. 5. 6. Детекция ДНК ВПЧ рода beta в образцах с себорейным кератозом и в образцах видимо здоровой кожи у иммуносупрессивных и иммунокомпетентных лиц Исследуемый образец Количество образцов ВПЧотрицательные образцы ВПЧположительные образцы абс. % абс. % Иммуносупрессивные: себорейный кератоз 20 3 15 17 85 видимо здоровая кожа у больных себорейным кератозом Иммунокомпетентные: 20 9 45 11 55 себорейный кератоз 20 6 30 14 70 видимо здоровая кожа у больных себорейным кератозом 20 13 65 7 35 Здоровая кожа доноров (контроль) 49 26 53 23 47 1- я - для выявления генотипов вида Р1 (типы 5, 8, 12, 14, 21. 19, 25, 47, 36); 2- я - для выявления генотипов вида Р2 (типы 9, 15, 17, 22, 23, 38, 37, 80); 3- я - для выявления генотипов вида Р3 (типы 49, 75, 76); 4- я - для выявления генотипов вида Р4 (тип 92), Р5 (тип 96), Р1 (типы 20, 24 и 93). Во все четыре системы введены олигонуклеотиды с целью выявления и количественного определения ДНК человека (по Р-глобиновому гену человека), что позволяло проводить оценку адекватности забора, хранения и обработки образцов (принцип внутреннего контроля). С учетом того, что при взятии клинического материала из очагов СК и здоровой кожи количество попадающих в образец эпителиальных клеток (а соответственно и копий вируса) варьировало, использовали методику нормирования количества вируса на количество клеток человека. Расчет нормализованной вирусной нагрузки производили по формуле: вирусная нагрузка = lg (количество ДНК ВПЧ/количество ДНК человека) . 105 [3]. Результаты Мониторинг предварительных данных (см. таблицу) показал, что у иммуносупрессивных больных (РПТ) множественные кератотические очаги появляются не только на открытых, но и на закрытых участках кожного покрова (рис. 2). В группе иммуносупрессивных пациентов с РПТ мы выявили высокую частоту ДНК ВПЧ рода beta - в 85% случаев в очагах СК и в 55% случаев на участках видимо здоровой кожи, что значимо выше, чем в группе здоровых лиц, где выявление ДНК ВПЧ рода beta отмечено лишь в 47% случаев. В группе иммунокомпетентных лиц частота выявления ДНК ВПЧ рода beta в очагах СК и на участках видимо здоровой кожи мы выявляли значимо реже - в 70 и 35% случаев соответственно. Вирусная нагрузка ДНК ВПЧ рода beta в СК и видимо здоровой коже у иммуносупрессивных пациентов с РПТ была высокой и составила 2,8 (1,9; 5,4) и 2,0 (1,3; 2,5) соответственно, поскольку распределения вирусных нагрузок носили ненормальный характер, значения представлены в виде медианы (25%о;75%о). У иммунокомпетентных лиц при анализе вирусной нагрузки в очагах СК отмечается ее уменьшение - 1,8 (1,2; 2,3), на участках видимо здоровой кожи нагрузка составила 2,2 (1,6; 1,8). Вирусная нагрузка ДНК ВПЧ в здоровой коже доноров была значимо ниже и составила всего 1,5 (0,9; 1,9). Рис. 2. Множественные себорейные кератомы на закрытых участках тела у иммуносупрессивного пациента. У РПТ с единичным СК (от 1 до 5 очагов по всему телу) ДНК ВПЧ рода beta обнаруживали в 43% случаев. При множественных очагах СК (5 и более) у РПТ отмечалась тенденция к более частому обнаружению ДНК ВПЧ рода beta - в 91% случаев. Сложность выявления ВПЧ в эпителиальных опухолях кожного покрова, вероятно, связана с ограничениями используемых методик молекулярной диагностики, при этом проведенный нами количественный анализ вирусных геномов позволил более объективно судить о характере присутствия ВПЧ в опухолях кожи. Мы считаем перспективным продолжение проведения исследований для подтверждения или опровержения роли ВПЧ рода beta в развитии эпителиальных опухолей в общей популяции и особенно среди иммуносупрессивных лиц.

About the authors

L. V Korneva

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research and Clinical Institute

Email: lvkorneva@mail.ru
Moscow, Russia

Elena S. Snarskaya

I.M. Setchenov First Moscow State Medical University

Email: snarskaya-dok@mail.ru
MD, PhD, DSc, prof. Moscow, Russia

V. A Molochkov

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research and Clinical Institute

Moscow, Russia

A. A Polyanskaya

Premium Esthetics Clinic

Moscow, Russia

References

Supplementary files