FEATURES OF EXPRESSION OF KI-67 AND NFE2L2 IN TARGET ORGANS OF MELANOMA METASTASIS IN PREMETASTATIC PHASE

Full Text

Ежегодный темп прироста заболеваемости меланомой в мире и составляет 3-8% [1], что представляет собой глобальную проблему не только в связи с ростом заболеваемости, но и c высокой резистентностью меланомы к терапии [2]. Важную роль в развитии и прогрессии опухоли играет опухолевое микроокружение, состоящее из нескольких важных компонентов, включая опухолевые, стромальные и мезенхимальные клетки, кровеносные и лимфатические сосуды, а также инфильтрирующие опухоль иммунные клетки [3]. Компоненты опухолевого микроокружения взаимодействуют с раковыми клетками, изменяя их молекулярный профиль, тем самым способствуя опухолевой прогрессии, инвазии и метастазированию. Кроме того, опухолевое микроокружение участвует в формировании опухолевой резистентности [4]. В клетках микроокружения изменяется уровень пролиферации, дифференцировки, экспрессия гипоксия-индуцибельного фактора [5]. Несколько видов стромальных клеток, включая эндотелиальные, клетки иммунной системы и фибробласты, выделяющие факторы роста, способствующих росту и пролиферации злокачественных клеток в микроокружении опухоли, признаны возможными объектами для снижения резистентности к противоопухолевой терапии и рецидива опухоли. Экспериментально выявлено, что воздействие на стромальные фибробласты вызывает подавление пролиферации клеток меланомы [6]. Таким образом, микроокружение опухоли играет важную роль в механизмах метастатического процесса [7]. Опухоль секретирует тканеспецифичные ангиогенные молекулы, под действием которых происходят существенные изменения в паренхиматозных органах, подверженных метастазированию, с формированием преметастатических ниш. Стромальные клетки трансформируются в так называемые опухоль-ассоциированные клетки, т.е. приобретают активированный, преимущественно, проопухолевый фенотип. Опухоль-ассоциированные фибробласты, в свою очередь, индуцируют ремоделирование стромы, необходимое для развития метастазов в органах-мишенях метастазирования меланомы. Пролиферация звездчатых клеток, фибробластов, секреция хемотаксических факторов, индукция ангиогенных факторов роста запускают в последующем процесс метастазирования посредством создания благоприятной среды в паренхиматозных органах [8]. Прогрессирование меланомы зависит от уровня клеточной пролиферации, одним из наиболее широко используемых маркеров пролиферативной активности является ядерный антиген Ki-67 [9], который является диагностическим маркером меланоцитарных новообразований и меланомы, так как выявлено, что индекс пролиферации данного антигена в меланоме выше, чем в меланоцитарных новообразованиях [10]. Также известно, что высокий индекс пролиферации Ki-67 является неблагоприятным прогностическим фактором при злокачественных опухолях молочной железы, мочевого пузыря, простаты [11]. В механизмах пролиферации, метастазирования и роста клеток меланомы принимает участие белок NFE2L2 [12], который отвечает за транскрипцию генов антиоксидантных белков, таких, как ферменты антиоксидантной защиты; интерлейкинов, обладающих протективным эффектом от окислительного повреждения. Уровень экспрессии NFE2L2 повышен при раке молочной железы, легких, печени [13]. Доказано, что белок NFE2L2 обладает протективным действием на клетки и ткани при воздействии токсинов и канцерогенов путем увеличения экспрессии цитопротекторных генов и снижения количества активных форм кислорода (ROS), а при повышенных уровнях экспрессии может также способствовать развитию резистентности к противоопухолевым препаратам [14]. Цель данного исследования - изучение уровня экспрессии NFE2L2 и маркера клеточной пролиферации Ki-67 в органах-мишенях метастазирования меланомы в преметастатическую фазу как компонентов формирующегося опухолевого микроокружения. Материалы и методы Использованы биоптаты опухолевого узла и органов мышей линии C57Bl6 (легкие, печень, почки), (мыши получены из вивария ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук») с перевитой меланомой В16 (культура была любезно предоставлена ФГБНУ «НИИ фундаментальной и клинической иммунологии»), в преметастатический период - 17-е сутки (n = 13), а также контрольной группы (n = 13). Органы фиксировали в 10% нейтральном формалине, заключали в парафин и изготавливали гистологические срезы толщиной до 4 мкм, на микротоме МС-2 («Точмедприбор», Украина), которые в дальнейшем подвергали иммуногистохимическому окрашиванию по стандартной методике [15] на маркер клеточной пролиферации Ki-67 (“ThermoFisher”, США). Уровень экспрессии Ki-67 определяли путем подсчета пролиферирующих клеток, имеющих положительно окрашенных ядра, при увеличении 400 с помощью микроскопа Olympus BX-41 (“Olympus”, Япония). В последующем производилось определение уровня экспрессии NFE2L2 в легких, печени, почках и опухолевом узле методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Из биоптатов органов мышей экспериментальной и контрольной групп выделяли РНК с помощью наборов для выделения РНК «Рибо-золь-С» и «Рибо-сорб» (“AmpliSens”, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией производителя, после выделения РНК проводилась реакция обратной транскрипции с помощью комплекта реагентов «Реверта» (“AmpliSens”, Россия). Синтезированную в результате обратной транскрипции кДНК использовали для постановки ПЦР-РВ, применяя специфичные праймеры к NFE2L2 и β-актину в качестве эндогенного контроля (“Applied Biosystems”, США). Также с целью подтверждения отсутствия метастатических очагов в органах-мишенях на 17-и сутки, поставлена ПЦР-РВ с праймером к Pmel (“Applied Biosystems”, США). Амплификацию и детекцию осуществляли методом ПЦР-РВ на приборе StepOne™ Real-Time PCR System (“Applied Biosystems”, Сингапур). Полученные результаты ПЦР были проанализированы по методу сравнения ΔCt, который определяет амплификационный цикл, во время которого флюоресценция образца становится достоверно выше базального сигнала. При сравнении данных использовали непараметрический метод при помощи U-критерии Манна-Уитни для двух независимых групп. Различия между сравниваемыми показателями считали статистически значимыми при p < 0,05. Результаты и обсуждение Меланома кожи метастазирует в лимфатические узлы и внутренние органы. Доказано, что толщина опухоли по Бреслоу коррелирует с выраженностью прогрессии заболевания: опухоль толщиной менее 0,75 мм, как правило, не дает отдаленных метастазов, в то время как опухоль более 1,5 мм, имеет больший риск отдаленного метастазирования [16]. Первые метастазы меланомы чаще всего появляются в регионарных лимфатических узлах и распространяются в кожу, подкожный слой, отдаленные лимфатические узлы, описаны случаи гематогенного распространения опухолевых клеток в органы-мишени, без поражения лимфатических узлов [17]. Гематогенное метастазирование меланомы чаще всего приводит к появлению очагов вторичного роста опухоли в легких. Как правило, отдаленные метастазы обнаруживаются через несколько лет после иссечения первичной опухоли. Также метастазирование меланомы осуществляется в печень, головной мозг, кости, сердце, почки и селезенку [18]. Общепризнанной экспериментальной моделью меланомы является меланома B16, доступность которой позволяет исследовать особенности метастазирования и тестировать новые возможности лечения меланомы кожи. По данным литературы, мышиная модель меланомы метастазирует двухступенчато: изначально в легкие, а затем вторично из легких в другие органы. Вторичные метастазы чаще всего имплантируются в почки, печень, головной мозг, яичники и поджелудочную железу [19]. Белок Кi-67 вырабатывается только в активно делящихся клетках и, поэтому, используется как маркер для определения пролиферирующих клеток в образцах ткани пациентов со злокачественными новообразованиями. Показано, что трансфекция в клетки олигонуклеотидов, блокирующих экспрессию Ki-67, тормозит пролиферацию клеток [19]. Для нормального роста различных клеточных линий необходим стабильный уровень экспрессии Ki-67 [20]. Выявлена взаимосвязь высоких уровней экспрессии Кi-67 с плохой выживаемостью при диссеминированной меланоме кожи [21]. Строма, ассоциированная с опухолью, является необходимым условием для инвазии и метастазирования опухолевых клеток и состоит из различных активно пролиферирующих клеток: фибробластов, перицитов, адипоцитов, макрофагов и иммунных клеток [22]. При оценке экспрессии Кi-67 в органах-мишенях метастазирования меланомы мышей контрольной и экспериментальной групп выявлено положительное иммунное окрашивание ядер в обеих группах. При этом уровень Ki-67, свидетельствующий о пролиферации клеток в тканях, возрастает в органах в преметастатическую фазу, в сравнении с группой контроля (рис. 1). NFE2L2 участвует в регуляции пролиферации клеток, хотя его точная роль не установлена. С одной стороны, показано, что у мышей, дефицитных по NFE2L2, наблюдается удлинение сроков регенерации ткани печени после гепатэктомии из-за снижения уровня пролиферации гепатоцитов посредством подавления сигнального пути PI3K-AKT [23]. С другой стороны, определено, что генами-мишенями NFE2L2 являются ингибиторы клеточного цикла циклинзависимые киназы Cdkn1a (p21) и Cdkn2b (p15) [24]. Оценивая относительные уровни экспрессии NFE2L2 в органах-мишенях метастазов меланомы (легкие, печень, почки), выявлено, что NFE2L2 статистически значимо изменяется в ткани печени и почек. Уровень экспрессии NFE2L2 в преметастатическую фазу в ткани легких выше в экспериментальной группе, и ниже в ткани печени и почек по сравнению с контрольной группой (рис. 2). Pmel-меланоцит ассоциированный антиген, присутствующий в нормальных меланоцитах и клетках меланомы, который используется в качестве меланома-специфических маркеров [25]. Pmel в легких, печени и почках не определялся, и был повышенным в опухолевом узле. Это свидетельствует об отсутствии клеток меланомы в органах-мишенях метастазирования новообразования и подтверждает, что исследование было выполнено на преметастатическом этапе развития процесса. Таким образом, понижение уровня NFE2L2 в ткани почек и печени может быть связано с ослаблением регуляторного влияния на Cdkn1a (p21) и Cdkn2b (p15) и, возможно, приводит к росту показателей клеточной пролиферации. Механизмы снижения уровня NFE2L2 в органах-мишенях метастазирования меланомы в преметастатический период требуют дальнейшего исследования, так как важны для понимания процессов диссеминации опухолевого роста.

About the authors

O. N Sergeeva

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Krasnoyarsk,660022, Russian Federation

N. V Palkina

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Krasnoyarsk,660022, Russian Federation

M. B Aksenenko

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Krasnoyarsk,660022, Russian Federation

A. V Komina

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Krasnoyarsk,660022, Russian Federation

E. Yu Sergeeva

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Krasnoyarsk,660022, Russian Federation

Tatiana G. Ruksha

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Email: tatyana_ruksha@mail.ru
MD, PhD, DSc., Head of Department of pathophysiology, KrasSMU n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky, Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation Krasnoyarsk,660022, Russian Federation

References

Supplementary files