EFFECTS OF LASER-INDUCED THERMOTHERAPY ON M-1 SARCOMA GROWTH KINETICS AND MORPHOLOGY

Full Text

Малоинвазивные щадящие лазерные технологии существенно уменьшают сроки и стоимость лечения, риск и тяжесть осложнений, представляя особый интерес в связи с возможностью их широкого использования [2]. Метод лазероиндуцированной термотерапии (ЛИТТ) основан на необратимости повреждения патологических клеток и тканей при воздействии высокой температуры (43—45°С) и отсутствии повреждений со стороны здоровой окружающей ткани [1]. Цель работы — изучить влияние ЛИТТ на кинетику роста и морфологию саркомы М-1. Материалы и методы Исследование проведено на половозрелых самцах белых беспородных крыс массой тела 160—180 г, содержавшихся в условиях вивария при естественном освещении и сбалансированном рационе питания в осенне-зимний период времени. Объектом исследования служила быстрорастущая соединительнотканная опухоль — саркома М-1. Она достаточно агрессивна, и ее самопроизвольное рассасывание наблюдается редко. Саркома М-1 относится к неметастазирующим, радиорезистентным, быстрорастущим опухолям с достаточно коротким инкубационным периодом, не превышающим 5—7 дней. Животные с трансплантированной опухолью живут 4—5 нед. Эта опухоль характеризуется достаточно большой биомассой и высокой степенью перевиваемости [4]. Саркома М-1 представляет низкодифференцированную соединительно-тканную опухоль с высоким пролиферативным потенциалом и низким уровнем спонтанного апоптоза [3]. С соблюдением правил асептики из опухоли крысы-донора получили материал для имплантации, который перенесли в чашку Петри с раствором Хенкса и добавлением 50 ЕД пенициллина. Далее удалили капсулу, некротизированные и геморрагические участки паренхимы опухоли и разрезали ее на фрагменты массой по 5—6 мг. После этого с помощью троакара кусочки опухоли вводили под кожу в правое бедро животных. За 7 дней до начала эксперимента с целью повышения точности измерения опухолей проводили обработку кожи бедра депиляцион-ным кремом [4]. Размер опухолей измеряли 2—3 раза в неделю. Определяли объем новообразований по формуле: V (объем опухоли, см3) = (π/6) х D1 х D2 х D3, где D1 — длина, D2 — ширина, D3 — высота опухоли в см. Сроки для гистологического изучения саркомы были определены по динамике и дивергенции линий роста опухолей в исследуемых группах. Изучение эффективности ЛИТТ проведено на двух группах животных с имплантированными опухолями. Методом случайного отбора животных-опухоленосителей распределили на группы, в каждую вошло по 15—20 крыс (от 3 до 5 животных на каждую экспериментальную точку). При выполнении исследований после перевивки крыс с опухолевыми узлами правильной формы выделили две группы по 15 животных: 1-я — контрольная, в которой крыс-опухоленосителей не под Результаты измерений объема опухолей (в см3) и параметры кинетики саркомы М-1 в контрольной и основной (леченой) группах животных (M ± m) Группа Время от имплантации/прививки опухоли, сут (время от начала ЛИТТ, сут) Параметры кинетики по формулам и уравнениям линий тренда 10 (-2) 12 (0) 13 (1) 16 (4) 24 (12) 33 (21) G (t0 — t21) β (t0 — t4) α1/α2 Контроль- 0,11 ± 0,01 0,20 ± 0,02 — 0,73 ± 0,06 4,02 ± 0,20 12,47 ± 1,02 1,51 ± 0,13 2,86 ± 0,2 0,25/0,94 ная группа ЛИТТ (основная группа) 0,15 ± 0,03 0,28 ± 0,06 0,28 ± 0,01 0 0,02 ± 0,01 0 -0,99 ± 0,005 вергали какому-либо воздействию, 2-я— основная, где крысы-опухоленосители получили ЛИТТ. В начале экспоненциальной стадии роста опухолей на 12— 14-е сутки после прививки при достижении объема новообразований 0,2—0,4 см3 животным 2-й группы проводили ЛИТТ с помощью медицинского лазерного аппарата ЛАМИ. Параметры светового воздействия были следующие: λ (длина волны) 1060 нм; мощность излучения (Р) — 2,5 Вт. Доставку излучения в опухоль проводили с помощью моноволоконного кварцевого световода диаметром волокна 0,6 мм. В 1-й группе животных (контроль) материал для исследования брали на 12, 16, 24 и 33-е сутки роста опухолей. Во 2-й (основная) группе — через 3 ч, 1 сут, 4, 12 и 21 сут после проведения сеанса ЛИТТ. Опухоли выделяли под нембуталовым наркозом (50 мг/кг). Животных умерщвляли после завершения опытов путем дека-питации. Ткань новообразований вырезали в виде пластинок толщиной 3—4 мм с ориентацией вдоль длинной оси, фиксировали 1 сут в кислой жидкости Буэна, обезвоживали. Микротомные срезы толщиной 6 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-Ь-лизина ("Sigma"). Общую гистологию саркомы изучали на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. При определении скорости прироста опухолей за этот период времени вычисляли среднюю геометрическую. Кинетику роста опухолей рассчитывали по уравнениям линий тренда для участков, соответствующих определенным стадиям развития саркомы [4]. Для статистической обработки полученных результатов использовали непараметрический U-критерий Манна—Уитни. Результаты Параметры роста новообразований суммированы в таблице и на рис. 1, 2. Контрольная группа. Латентный период времени до появления опухолевых узелков составил 6—8 дней. Опухоли привились у всех животных, достигнув к 10-м суткам размера, позволяющего проводить измерения. Самопроизвольного рассасывания привившейся саркомы не выявили. В период 10—24 сут новообразования росли в узком диапазоне варьирования. В линейном масштабе рост саркомы М-1 соответствует по средним значениям кривой, характерной для большинства быстрорастущих экспериментальных новообразований. Наиболее интенсивный рост опухолей наблюдается до 24 сут (t0 — t12). В этот период кривая роста отображается экспонентой: Vt = V0 χ eat . Кривая выпрямляется в линейных координатах после 24 сут (t12—t21). В интервале времени 24—33 сут по уравнению линии тренда определяется линейная зависимость роста объема по формуле: Vt = V0 + αΐ В начальном периоде роста (t0 — t4) получен коэффициент β = 2,86 ± 0,2; в интервале t0 — t12 a 1 = 0,25; в период t12 — t21 α 2 = 0,94. По средней геометрической прирост массы новообразований составил 1,51 ± 0,13. Замедление скорости роста отдельных опухолей было отмечено с 4-й недели после имплантации. На 12—16-е сутки в начале экспоненциальной фазы роста саркома М-1 представляла новообразование с явлениями тканевой и клеточной атипии, состоящее из веретенообразных и полиморфных клеток. Опухолевые узлы отграничены от окружающих тканей тонкой соединительнотканной капсулой, инфильтрированной незначительным количеством полиморфно-ядерных лейкоцитов и мононуклеаров. Отметили зональную неоднородность сосудистого русла. Наиболее васку-ляризированы были периферические участки, прилегающие к здоровым тканям. От располагающихся в подкожной клетчатке и капсуле магистральных сосудов ответвлялись капиллярные петли, которые затем врастали в паренхиму опухоли. В подкапсульной зоне опухолевые клетки располагались рыхло, отделены а б в Рис. 1. Кинетика роста саркомы М-1 в контрольной группе. Рост опухолей: а — по средним значениям; б — в экспоненциальной фазе; в - в линейной стадии. Здесь и на рис. 2: T — время от имплантации опухоли, сут; t - время от начала ЛИТТ, сут. 59 РОССИЙСКИЙ ЖУРНАЛ КОЖНЫХ И ВЕНЕРИЧЕСКИХ БОЛЕЗНЕЙ Рис. 2. Кинетика роста саркомы М-1 после ЛИТТ, рост опухолей по средним значениям. друг от друга тонким слоем межклеточного матрикса. В участках солидного строения клетки саркомы М-1 располагались плотно. Форма ядер овальная вытянутая, в ряде случаев неправильная. На 24—33-е сутки после прививки паренхима новообразований у крыс контрольной группы сохраняла полиморфный гистеоидный тип строения. К 24-м суткам средний объем опухолей составляет 4 см3 и к 33-м суткам увеличивается до 12,5 см3. Тем ни менее не обнаружили признаков прорастания опухолевыми клетками со-единительно-тканной капсулы. Усилилась зональная неоднородность строения паренхимы. Солидный тип организации сохранялся по периферии. На препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, центральные зоны опухолевых узлов представлены оксифильными полями спонтанного некроза. По периферии новообразований обнаружили небольшие по размеру очаги некроза. ЛИТТ саркомы М-1. Через 3 ч после ЛИТТ микроскопически рыхлая соединительная ткань под кожей и вокруг опухолевых узлов пропитана плазмой. Определяются расширенные и полнокровные окружающие опухоль сосуды, в просвете которых формируются эритроцитарные тромбы. Вдоль погибших сосудов паренхима представлена полями и прослойками опухолевых клеток в состоянии коагуляции, между которыми отмечаются фрагменты опухолевой ткани со сжатыми и гиперхромными клетками. В просвете погибших сосудов — сетевидное эозинофильное содержимое и отдельные лейкоциты. Признаков массивного плазматического и геморрагического пропитывания паренхимы не выявили. Стенка отдельных сосудов полностью разрушена, но кровоизлияния на относительно небольшой площади. Отметили полную остановку микроциркуляции и гемодинамики в новообразовании. Через 1 сут в зоне ЛИТТ подкожная припухлость. Воспалительный вал окружает погибшие ткани. Со стороны менее поврежденных тканей пролиферация фибробластов, с участием макрофагов активная элиминация погибших клеток. Обнаружили капиллярные петли неоангиогенеза. Признаки опухоли к 4-м суткам отсутствовали. До дистрофически измененных поперечно-полосатых мышц просматривается глубокий некроз опухолей и окружающих их тканей. К 12-м суткам отметили окруженные воспалительным валом и разрастающейся соединительной тканью фрагменты зон некроза новообразований и погибшей мышечной ткани. К 21-м суткам исчезла припухлость окружающих опухоль тканей. В толще склерозирован-ной ткани — небольшие участки, содержащие небольшие группы недавно погибших и погибающих клеток новообразования. Эти зоны инфильтрированы лимфоидными клетками и макрофагами. Не выявили активной пролиферации опухолевых клеток. Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о выраженной эффективности ЛИТТ в экспериментах на крысах с имплантированной соединительнотканной опухолью — саркомой М-1. Основное противоопухолевое действие ЛИТТ обусловлено сочетанным разрушением микроцирку-ляторного русла и развитием некроза. Полученные результаты, вероятно, могут стать теоретической основой для разработки эффективного протокола ЛИТТ в клинической практике.

About the authors

Yu. S Romanko

V. A Molochkov

T. E Sukhova

Email: tats64@mail.ru

V. V Popuchiev

A. V Molochkov

E. I Tretyakova

S. V. Korenev

Yu. A Belyi

Email: k.v.akopova@gmail.com

K. V. Akopova

References

Supplementary files