Role of extracorporeal photochemotherapy in induction of the inhibitory mechanisms of immune response regulation in local scleroderma

Full Text

Ограниченная склеродермия (ОС) - аутоиммунное заболевание с прогрессирующим поражением кожи и подкожной клетчатки с преобладанием фиброзно-склеротических и сосудистых нарушений по типу облитерирующей микроангиопатии [1, 2]. В настоящее время в патогенезе склеродермии выделяют три взаимосвязанных патологических процесса: поражение мелких артериол и капилляров, мононуклеарная инфильтрация и избыточная продукция коллагена фибробластами [3-6]. Клеточный инфильтрат на ранних стадиях заболевания состоит из Т-клеток, макрофагов, В-клеток. Т-клетки представлены преимущественно CD4+-клетками, обеспечивающими олигоклональную пролиферацию T-хелперных клеток 2-го типа (Th2), что подтверждается повышенным содержанием соответствующих цитокинов: IL-10, CTLA-4, TGF-p. В-клетки представлены СБ20+-лимфоцитами, которые участвуют в иммунопатогенезе заболевания посредством синтеза аутоантител [3, 7]. Таким образом, современная концепция иммуногенеза ОС базируется преимущественно на аномально повышенной активности гуморальной составляющей иммунного ответа на собственные антигены, генерируя при этом специфические аутоантитела, цитокины и другие факторы, которые обнаруживаются в сыворотке пациентов. Известно, что контроль продукции гуморальных факторов зависит от функциональной направленности CD4+ Т-клеток, которая обеспечивается присутствием на мембране этих клеток активационных и ко-активационных сигнальных молекул, реализующих тип и направленность иммунного ответа. Нарушение регулирующей функции CD4+ Т-клеток может играть важную роль в патогенезе этого заболевания, зависящую от степени экспрессии мембранных акцессорных (дополнительных) рецепторов. К наиболее значимым из них относят ко-активационные молекулы (CD28 и CD27), реализующие второй сигнальный путь активации Т-клеток, селектиновые и интегриновые молекулы адгезии (CD62L, CDiib. CD 18), обеспечивающие трансэндотелиальную миграцию мононуклеарных клеток и их взаимодействие и др. [8-11]. Современная теория патогенеза ОС не учитывает значение и роль присутствия этих молекул на иммунокомпетентных клетках как ключевых факторов в формировании, поддержании и прогрессировании аутоиммунного процесса. Недостаточные знания в области иммуногенеза данного заболевания приводят к недостаточной клинической эффективности предлагаемых методов лечения, основанных преимущественно на подавлении активности гуморальной составляющей адоптивного иммунного ответа. В связи с этим представляло интерес выяснение роли молекул ко-активации CD28 и CD27 на CD4- и CD8+-лимфоцитах в формировании аутоиммунного процесса при ОС, а также селектиновой молекулы адгезии CD62L. В последующем, основываясь на полученных результатах, разработать и обосновать целесообразность применения нового перспективного метода экстракорпоральной фотохимиотерапии (ЭФХТ) в качестве лечебных процедур при ОС, а также механизм действия этого вида лечения. Метод ЭФХТ основан на фотосенсибилизирующем действии 8-метоксипсоралена (8-МОП) и ультрафиолетового облучения А (УФА) на монону- клеарные клетки, которые выделяют с помощью ци- тафереза и реинфузируют пациенту. Имеются многочисленные данные об успешном применении ЭФХТ в лечении атопического дерматита [12], вульгарной пузырчатки [13], псориатического артрита [14], саркомы Капоши [15]. Об эффективности ЭФХТ при ограниченной склеродермии имеются только единичные публикации [16]. Цель исследования - изучение роли ко-актива- ционных молекул CD27 и CD28 на эффекторных клетках иммунной системы в формировании аутоиммунного процесса при ограниченной склеродермии и механизмы их коррекции ЭФХТ. Материалы и методы Под нашим наблюдением находились 50 больных (4 мужчин и 46 женщин) с различными формами ОС в возрасте от 14 до 68 лет (средний возраст 47,5 ± 14,8 года), которые были разделены на две группы. В основную группу были включены 25 пациентов, получавших комплексное лечение с применением ЭФХТ и стандартной терапии (пенициллин, лида- за, сосудистые препараты). Ранее 20 (80%) пациентов данной группы неоднократно получали курс стандартной терапии (1-4 раза в год), делагил, плакве- нил, преднизолон, однако выраженного клинического эффекта добиться не удавалось. Контрольную группу составили 25 пациентов, которые получали только стандартную терапию. Методика ЭФХТ заключалась в следующем: проводили выделение мононуклеарных клеток с помощью клеточного сепаратора Haemonetics MCS+ по протоколу RBCP (выделение стволовых клеток). За одну процедуру выделяли от 40 до 70 мл концентрата мононуклеар- ных клеток, которые ресуспендировали в 0,9% растворе хлористого натрия, доводя общий объем до 200 мл. Клеточную суспензию подвергали УФ воздействию на аппарате «ЮЛИЯ» при длине волны 320-380 нм. Общая доза экспозиции составляла 0,8-1,2 Дж/см2. В качестве фотосенсибилизатора использовали отечественный препарат аммифурин в дозе 0,6 мг/кг, который пациент принимал за 2 ч до процедуры. После облучения клетки реинфузировали в течение 30 мин. Курс лечения включал 4 сеанса через 1-2 дня. Иммунофенотипические исследования проводили в иммунологической лаборатории Московского городского центра СПИД Департамента здравоохранения города Москвы (руководитель - доктор мед. наук А.И. Мазус, руководитель лабораторного отдела - А.Я. Ольшанский) методом проточной цитометрии на цитометре Cytomics- FC 500 (“Beckman Coulter”). Предподготовку проводили на автоматической станции TQ-prep. Общий анализ крови проводили на гематологическом анализаторе Sysmex ICX-21. Проводили 5-параметровый проточно-цитофлюори- метрический субпопуляционный анализ поверхностных антигенов с использованием коммерческих моноклональных антител к поверхностным антигенам CD3. CD4, CD8, CD27, CD28, CD62L, CD19, CD16, CD56 фирмы “Beckman Coulter”, конъюгированных FITC, PE, ECD, PC5, и PC7. В качестве контроля применяли коммерческие сыворотки, содержащие изотипические антимышиные Ig, конъюгированные соответствующим флюорохромом. Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методикам, с помощью пакета анализа MS Office 2007 для Windows 7 и программы Statistica v. 6.0. Результаты Клиническая оценка эффективности лечения Для оценки эффективности лечения у каждого больного рассчитывали индексы относительного уменьшения клинических признаков в процентах: снижение выраженности эритемы, снижение интенсивности индурации и площади поражения. Далее по формуле выводили суммарный индекс относительного уменьшения поражения кожи: И = [И + (И + И ):2] / 2, к L э 4 п и7 J где Ик - индекс относительного уменьшения поражения кожи, Иэ - индекс снижения интенсивности эритемы, Ип - индекс снижения площади поражения, Ии - индекс снижения интенсивности индурации. Т аблица 1 Экспрессия линейных лимфоцитарных антигенов у больных ограниченной склеродермией в сравнении с показателями контрольной группы (доноров крови) (М ± m) Кластер дифференци- ровки лимфоцитов Обследуемая группа контроль (доноры), % (п = 20) больные ОС, % (п = 25) CD3+ 62,8 ± 1,1 71,1 ± 5,7 CD3+CD4+ 37,1 ± 1,2 48,8 ± 8 CD3+CD8+ 25,5 ± 1,2 21,3 ± 6,7 ИРИ (CD4/CD8) 1,45 ± 0,6 2,63 ± 1,34 CD3-CD16+CD56+ 10,3 ± 2,3 10,1 ± 4 CD3-CD19+ 11,2 ± 2,1 10,9 ± 2,9 Примечание. Здесь и в табл. 3: p > 0,05 - различия в обследованных группах статистически незначимы. Критерии эффективности лечения: клиническое выздоровление - Ик составляет 95% и более, значительное улучшение - Ик 51-94%, улучшение - Ик 25-50%, отсутствие эффекта - Ик менее 25%. Среднее значение Ик (M ± m) у пациентов основной группы после комплексного лечения с применением ЭФХТ составило 57,96 ± 4,38%, из них у 24 (96%) пациентов результаты трактовали как значительное улучшение, у 1 (4%) - улучшение. Среднее значение Ик (M ± m) у пациентов контрольной группы составило только 34,94 ± 4,23%, из них у 24 (96%) пациентов наблюдали улучшение, у 2 (8%) пациентов не удалось добиться достаточно значимого клинического улучшения. Таким образом, значительно более выраженный клинический результат был достигнут у пациентов основной группы. Динамика иммунологических показателей в периферической крови до и после лечения ЭФХТ Для оценки иммунологического профиля у больных основной группы была изучена экспрессия основных линейных дифференцировочных антигенов. Существенных изменений в экспрессии основных линейных лимфоцитарных антигенов у больных ОС по отношению к здоровым донорам мы не отметили (табл. 1). Таблица 2 Экспрессия молекул ко-активации и адгезии на эффекторных Т-лимфоцитах у больных ограниченной склеродермией в сравнении с показателями контрольной группы (доноров крови) и в процессе ЭФХТ (М ± m) Обследуемая группа Иммунофенотип контроль (донобольные ОС, % (п = 25) ры), % (п = 18) до ЭФХТ после ЭФХТ СD3+CD4+CD28+CD27+CD62L+ 56,6 ± 3,2 72,3 ± 6,5* 54,2 ± 6,1** СD3+CD4+CD28+CD62L+ 45,6 ± 3,2 64,1 ± 7,1* 47,5 ± 5,1** СD3+CD8+CD27-CD28-CD62L+ 16,4 ± 2,1 20,8 ± 3,4 30,1 ± 5,2*** Примечание. p < 0,05 - статистически значимые различия между: * - больными ОС до ЭФХТ и показаниями контрольной группы (доноры крови); ** - больными ОС до и после ЭФХТ; *** - больными ОС после ЭФХТ и показаниями контрольной группы (доноры крови). Это послужило основанием провести детальные иммунологические исследования, характеризующие процессы активации и пролиферации на основании изучения экспрессии молекул ко-активации CD28 и CD27 и селек- тиновой молекулы адгезии CD62L на эф- фекторных CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах. Известно, что молекула CD27 является основным дифференцировочным антигеном, реализующим потенциал дифференцировки В- и Т-лимфоцитов путем взаимодействия со своим лигандом СD70 на этих клетках, а CD28 является одним из основных ко- активационных рецепторов, участвующих в патогенезе аутоиммунных заболеваний. Для изучения функциональных особенностей иммунокомпетентных клеток у больных ОС был проведен анализ экспрес- CD4+CD28+CD27+CD62L+ Ш7 CD4+CD28+CD62L+ О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 % I Больные ОС Ш Здоровые доноры Рис. 1. Экспрессия ко-активационных маркеров CD27 и CD28, а также селектиновой молекулы адгезии CD62L на CD4+ Т-лимфоцитах у больных ограниченной склеродермией и в группе контроля (доноры крови). сии селектиновой (CD62L) молекулы адгезии на лимфоцитах периферической крови. Необходимость такого изучения была обусловлена сведениями о взаимодействии молекул адгезии со своими лигандами в строме органов, в результате которого возникают сигналы, блокирующие апоптоз и приводящие к накоплению лимфоидных клеток с развитием соответствующей клинической симптоматики. Относительное количество CD4+ Т-клеток, имеющих фенотип CD4CD28CD27CD62L+ у больных ОС, было статистически значимо выше (72,3 ± 12,2%), чем в контрольной группе (доноров крови) (56,6 ± 3,2%) (p < 0,05) (табл. 2 и рис. 1).Это увеличение обусловлено преимущественно за счет молекулы CD27 и в меньшей степени CD28, хотя уровень ее экспрессии на СD4+ Т-лимфоцитах у больных ОС также был статистически значимо повышен (64,1 ± 10%) в сравнении со здоровыми донорами (45,6 ± 3,2%) (p < 0,05). Это свидетельствует о том, что наиболее существенную роль в патогенезе ОС имеет не столько количественное значение, сколько функциональное состояние CD4+ Т-клеток. Оно определяется присутствием на их мембране ко-активационных маркеров и молекул адгезии, регулирующих направленность иммунного ответа благодаря синтезу соответствующих цитокинов и молекул межклеточного взаимодействия. Можно предположить, что пусковым моментом экспрессии мембранных молекул CD27 является полная активация Т-клеток, которая реализуется через второй сигнальный путь благодаря взаимодействию рецептора CD28 на CD4+ Т-лимфоцитах со % 40 -| 35 - 30 - 25 - 20 - 15 - 10 - 5 - Здоровые доноры Больные ОС Больные ОС до ЭФХТ после ЭФХТ Рис. 2. Экспрессия ко-активационных маркеров CD27 и CD28, а также селектиновой молекулы адгезии CD62L на CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах у больных ограниченной склеродермией в процессе ЭФХТ. своим лигандом CD80/CD86 на дендритных анти- генпрезентирующих клетках. Это дает основание рассматривать CD4+ Т-лимфоциты, имеющие иммунофенотип CD4+CD28+CD27+CD62L+, в качестве индукторов повышения пролиферативных, дифферен- цировочных и адгезивных свойств, а молекулу CD27 на этих клетках - в качестве маркера активности иммунной системы при ОС. Присутствие селектиновой молекулы адгезии на CD4+ Т-лимфоцитах у здоровых людей обеспечивает их адгезию к активированному сосудистому эндотелию в начальной фазе воспаления и хоминг их из кровотока в периферические лимфоузлы. С их помощью осуществляется антигенопосредованная активация Т-клеточного рецептора CD28, молекул ко-активации класса B7 (CD80, CD86), а также взаимодействие с В-лимфоцитами. Статистически значимое и значительное повышение экспрессии лимфоцитарной селектиновой молекулы адгезии CD62L на CD4+-лимфоцитах у больных ОС, свидетельствовало об активации процессов трансэндотелиальной миграции этих лимфоцитов к клеткам мишеням. Присутствие адгезионных молекул на поверхности CD4+-клеток может быть одной из причин повышенной активации Т-клеточного рецептора, что влечет усиление аутоиммунного воспалительного процесса при ОС. Очевидно, что CD4+ Т-клетки с таким иммунофенотипом обеспечивают пролиферацию аутоагрессивных цитолитических CD8+ Т-лимфоцитов, а также способны трансформировать В-лимфоциты в Таблица 3 Экспрессия кластеров (в %) дифференцировки лимфоцитов у больных с ограниченной склеродермией до и после ЭФХТ (М ± т) Экспрессия кластеров дифференцировки лимфоцитов до ЭФХТ (п = 25) после ЭФХТ (п = 25) CD3+ 71,1 ± 5,7 69,8 ± 6,1 CD3+CD4+ 48,8 ± 8 47,3 ± 8,6 CD3+CD8+ 21,3 ± 6,7 20,8 ± 6,2 CD3-CD16+CD56+ 10,1 ± 4 11,7 ± 4 CD3-CD19+ 10,9 ± 2,9 10,2 ± 2 плазматические клетки, что обеспечивается присутствием на В-клетках лиганда для рецептора СD27 - молекулы CD70. В последующем плазматические клетки способны синтезировать в растворимой форме антигенспецифические аутоантитела. Преобладающий характер экспрессии молекулы CD27 на CD4 Т-лимфоцитах дает основание предположить, что она вместе с молекулой CD28 играет ключевую роль в иммуногенезе ОС, отражая степень и стадию патологического процесса. При анализе иммунофенотипа косвенно, отражающего степень негативной активации Т-лимфоцитов СD3+CD8+CD62L+СD27"CD28", в плане обеспечения процессов анергии к презентируемым аутоантигенам, было установлено увеличение относительного количества этих клеток у больных ОС, хотя и недостоверное (20,8 ± 3,4% по сравнению с нормой 16,4 ± 2,1%; р > 0,05) (см. табл. 2 и рис. 2). Из этого следует, что механизмы, ингибирующие Т-клеточную активацию и инициирующие процессы толерантности к презентируемым аутоантигенам при ОС, также повышены, однако они недостаточны для того, чтобы сдерживать процессы активации и дифференцировки. Таким образом, эффекторные клетки иммунной системы у больных ОС характеризуются, с одной стороны, выраженным активационным иммунофенотипом, реализующимся через повышенную экспрессию CD27- и CD28-молекул на CD4+ Т-лимфоцитах, а с другой - присутствием антигено- посредованных клеток с толерогенным иммунофенотипом СD3+CD8+CD62L+СD27"CD28". Полученные данные позволяют рассматривать модификацию иммунной системы у больных ОС как результат, обусловленный функциональными изменениями иммунокомпетентных клеток, приводящий к дисрегуляции их взаимодействия через молекулы межклеточной адгезии и ко-активации, что предопределяет возможность аутоиммунной агрессии. Выявленные особенности изучаемых биомаркеров иммунной системы при ОС послужили основанием для использования их в качестве мишеней патогенетического воздействия ЭФХТ. В процессе проведения ЭФХТ мы не наблюдали статистически значимых изменений экспрессии основных линейных дифференцировочных антигенов (табл. 3). Однако было выявлено, что в результате ЭФХТ происходит снижение экспрессии ко-активационных Ш До лечения Ш После ЭФХТ Рис. 3. Сравнительный анализ экспрессии СD3+CD8+ CD62L+ CD27-CD28- у больных с ограниченной склеродермией до и после лечения ЭФХТ и в группе контроля (доноры крови). маркеров CD27 и CD28 на CD4+ Т-лимфоцитах, что приводит к индукции процессов негативной активации Т-клеточного рецептора и восстановлению механизмов иммунологической толерантности к собственным антигенным структурам (см. табл. 2 и рис. 3). Подтверждением этого служит уменьшение цито- литических свойств CD8 Т-лимфоцитов и увеличение их супрессорных функций за счет еще большего снижения коэкспрессии молекулы CD28 и CD27 на поверхности CD8+-клеток (до лечения ЭФХТ 20,8 ± 3,4%, после лечения ЭфХт 30,1 ± 5,2%; р > 0,05) (см. табл. 2 и рис. 2). В результате эти клетки приобретают регуляторный иммунофенотип: СD3+CD8+CD62L+СD27"CD28", обеспечивающий и поддерживающий периферическую иммунологическую толерантность путем делеции аутореактивных цитолитических лимфоцитов, индуцируя в них процессы апоптоза. Примечательно, что это увеличение не носило статистически значимый характер, тем не менее различия между экспрессией супрессорных CD8+ Т-лимфоцитов после ЭФХТ и нормой были статистически значимыми (30,1 ± 5,2% при норме 16,4 ± 2,1%;р < 0,05) (см. табл. 2 и рис. 3). Таким образом, в ходе исследования было установлено, что количественное определение основных линейных лимфоцитарных антигенов при ОС не имеет существенного прогностического и диагностического значения. Основное значение в формировании локального аутоиммунного процесса при ОС имеет изменение функциональных свойств иммунокомпе- тентных клеток, играющих центральную роль в поддержании иммунологического гомеостаза. В процессе работы было установлено, что у больных ОС на разных стадиях патологического процесса происходит дисбаланс функциональных свойств этих клеток с преобладанием активационных сигнальных путей за счет повышенной экспрессии ко-активационных молекул CD28 и CD27 на CD4+ Т-клетках над сдерживающими - ингибирующими сигналами со стороны супрессорных CD8+-лимфоцитов, находящихся в терминальной стадии дифференцировки, благодаря лишения ко-активационных молекул в присутствии селективной молекулы адгезии CD62L. Это приводит к пролиферации аутореактивного клона цитолитических лимфоцитов и активации гуморальной составляющей адоптивного иммунного ответа. Возможно, триггером этого процесса являются экзо- и эндогенные факторы, повреждающие геном клеток фибробластов [17-20]. В результате активируются транскрипционные факторы, запускающие процессы пролиферации клона специфических аутореактивных цитолитических лимфоцитов и синтез аутоантител с помощью рецепторно-лигандных молекул. Существует доказательство того, что основной эффект одновременного участия T-клеточного рецептора и молекулы ко-активации CD28 заключается в увеличении амплитуды транскрипции генов, таких как IL-2, IL-4 и др. [21]. На основании изучения механизма положительного действия ЭФХТ при ОС можно прийти к заключению о том, что точкой приложения ЭФХТ являются только те мембранные рецепторы, экспрессия которых значительно увеличена по сравнению с нормой и не затрагивает экспрессию рецепторов, не вовлеченных в патологический процесс. Возможно, что под влиянием этой процедуры активируются процессы шеддинга (слущивания) мембранных рецепторов в результате ферментативного лизиса трансмембранных доменов этих рецепторов. Однако возможен и другой механизм, в основе которого лежит нарушение транскрипции соответствующей матричной РНК, что приводит к замедлению процессов трансляции кодируемого ею рецептора. Возможен и третий механизм: при формировании вторичной матричной РНК, происходит сплайсинг тех экзонов, которые кодируют трансмембранные домены данных рецепторов.Это может быть результатом воздействия активированной в результате УФ-света молекулы метоксипсоралена на пиримидиновые основания молекулы РНК во время ее ускоренной транскрипции. Известно, что молекула метоксипсо- ралена обладает высокой афинностью к тиминовым основаниям ДНК и РНК. В результате чего она ин- теркалирует между ними, а под воздействием УФ- света эта связь становится прочной, что приводит к нарушению процесса транскрипции. В результате транслируется рецепторная молекула в растворимой форме, которая в свою очередь может играть роль ци- токина, взаимодействуя со своим лигандом, нарушая при этом процессы активации Т-клеток и уменьшая пролиферацию аутоагрессивных эффекторных клеток. Все это способствует восстановлению иммунного гомеостаза со стороны процессов активации и ее ингибирования на иммунокомпетентных клетках. Метод ЭФХТ имеет выраженную патогенетическую направленность при ОС, воздействуя на избыточный синтез ко-активационных молекул, приводящий в последующем к снижению аутоиммунного воспаления и поддержанию длительной и стойкой ремиссии. В отличие от гормональной и иммуносу- прессивной лекарственной терапии ЭФХТ не вызывает побочных реакций и осложнений, что позволяет рекомендовать его для внедрения в стандарты лечебной практики.

About the authors

A. V Kildyushevsky

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research and Clinical Institute

Email: kildushev@yandex.ru
129110, Moscow, Russia

Vladimir A. Molochkov

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research and Clinical Institute

Email: derma@monikiweb.ru
MD, PhD, DSc, prof. 129110, Moscow, Russia

A. V Molochkov

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research and Clinical Institute

Email: Antmd@yandex.ru
129110, Moscow, Russia

O. A Fomina

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research and Clinical Institute

Email: dr.fominaoa@gmail.com
129110, Moscow, Russia

References

Supplementary files