Problems of Biological Medical and Pharmaceutical ChemistryProblems of Biological Medical and Pharmaceutical ChemistryВопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии1560-95962587-7313Russkiy Vrach Publishing House11272510.29296/25877313-2020-03-01ArticlesСтатьиResearch ArticleCHO cell line selection for development of stable cell line producing recombinant human follicle-stimulating hormoneВыбор клеточной линии для получения штамма-продуцента рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человекаMonakhovaV. SМонаховаВ. С

биолог

v.s.monakhova@hpb.spb.ruPigarevaN. VПигареваН. В

к.м.н., вед. биолог

SimbirtsevA. SСимбирцевА. С

чл. -корр. РАН, д.м.н., профессор, науч. руководитель

FGUP «State Research Institute of Highly Pure Biopreparations» of the Federal Biomedical AgencyФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов»15032020233VOL 23, NO3 (2020)ТОМ 23, №3 (2020)3717112022Copyright ©; 2020, Russkiy Vrach Publishing HouseCopyright ©; 2020, ИД "Русский врач"2020Russkiy Vrach Publishing HouseИД "Русский врач"https://journals.eco-vector.com/1560-9596/article/view/112725

Follicle-stimulating hormone (FSH) is one of the most important hormones of reproductive system and it is widely used as a treatment in an assisted reproductive technology. Choice of productive cell line for recombinant human FSH (rhFSH) protein production is the major issue of biotechnological process. Study objective. The aim of the study was to generate stable cell lines for rhFSH production using different parental CHO cell lines and compare their characteristics. Material and methods. Two CHO suspension parental cell lines were used for stable cell line generation - CHO-K1 and CHO-DXB 11 adapted to suspension conditions. Cell count and viability were analyzed by trypan blue exclusion method. RhFSH concentration was measured by ELISA, protein identity was confirmed by western blot analysis. Results. Four clones generated from CHO-DXB 11 cell line were selected after 3 steps - pool selection, clone selection and methotrexate amplification. Productivity during 6 days of cultivation for the most productive clone CHO-FSH 11/24 was 7,1±0,6 mg/l. Three clones were chosen after transfection and cell cloning of CHO-K1 cells transfected with plasmids containing of FSH α- and β-chains sequences. The highest productivity was detected for CHO-FSH91 clone and it was 10,8±0,9 mg/l. Molecular weight of rhFSH was identical for rhFSH purified from cell culture of optimal clones and commercial preparation Gonal-F (Merck Serono).

Фолликулостимулирующий гормон - это один из важнейших гормонов репродуктивной системы человека, который широко используется во вспомогательных репродуктивных технологиях. Выбор штамма-продуцента рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека (рчФСГ) одна из ключевых задач биотехнологического процесса. Цель работы. Целью работы являлось получение стабильной клеточной линии, продуцирующей рчФСГ, с использованием двух различных родительских клеточных линий СНО. Материалы и методы. Для получения стабильных клонов, продуцирующих рчФСГ, были использованы две клеточные линии -СНО-К1 и СНО-DXB 11, адаптированные к культивированию в бессывороточной среде. Подсчет клеток и оценку клеточной жизнеспособности осуществляли с помощью окраски трипановым синим. Концентрацию рчфСГ определяли методом иммуноферментного анализа, подлинность белка определяли методом вестерн-блотинга. Результаты. Четыре наиболее продуктивных клона, полученные с использованием клеточной линии CHO-DXB 11, были отобраны после трех этапов скрининга - отбор пула, селекция клонов и амплификация с использованием метотрексата. Наибольшей продуктивностью в течение 6 дней культивирования обладал клон CHO-FSH 11/24 - 7,1±0,6 мг/л. Три клона были выбраны после траснфекции и отбора клонов с использованием клеточной линии CHO-K1. Клон CHO-FSH 91 обладал наибольшей продуктивностью после 6 дней культивирования - 10,8±0,9 мг/л. Молекулярные массы препаратов рчФСГ, полученных от разных клеточных линий-продуцентов, совпадали с молекулярной массой коммерческого препарата «Гонал Ф» (Merck Serono). Выводы. Продуцент, полученный с помощью клеточной линии СНО-К1, будет использован для дальнейших экспериментов.

CHO-FSH91 clone which was generated from CHO-K1 cell line was chosen for the further experimentsштамм-продуцентфолликулостимулирующий гормон человекасуспензионные клеточные линии СНОLatash W.D., Karande V.C., Klipstein S. The development of recombinant follicle stimulating hormone (rFSH) for use in the treatment of infertility: new solutions to old challenges. Reviews in Gynaecological Practice. 2004; 4:203-210.Keene J.L., Matzuk M.M. et al. Expression of biologically active human follitropin in chinese hamster ovary cells. The Journal of Biological Chemistry. 1989; 264(9):4769-4775.Olijve W., Boer W. et al. Molecular biology and biochemistry of human recombinant follicle stimulating hormone (Puregon®). Molecular Human Reproduction. 1996; 2(5):371-382.NA K.H., Seo K.S., Kim W.B., Kim S.-Ch., Lee S.-H., Lee K.S. Purification and Characterization of Recombinant Human Follicle Stimulating Hormone Produced by Chinese Hamster Ovary Cells. J. Microbiol. Biotechnol. 2005; 15(2):395-402.Kim D.J., SeokS.-H., BaekM.-W., Lee H.-Y., Juhn J.-H., Lee S. et al. Highly expressed recombinant human follicle-stimulating hormone from Chinese hamster ovary cells grown in serum-free medium and its effect on induction of folliculogenesis and ovulation. 2010; 93(8):2652-2660.Патент № 2615447 (РФ). Синтетическая ДНК, кодирующая интерлейкин-7 человека, содержащий ее экспрессионный вектор (варианты), штамм-продуцент интерлейкина-7 человека и способ получения интерлейкина-7 человека. Ищенко А.М., Кудлинг Т.В., Петров А.В., Пигарева Н.В., Протасов Е.А., Симбирцев А.С. 2017.Патент № 2616273 (РФ). Синтетическая ДНК, кодирующая антимюллеров гормон человека, содержащий ее экспрессионный вектор pTVK4pu/MISOPT и штамм клеток яичников китайского хомячка CHO-MIS - продуцент рекомбинантного антимюллерового гормона человека. Петров А.В., Карасев М.М., Кудлинг Т.В., Пигарева Н.В., Сергеева В.Е., Трофимов А.В., Ищенко А.М., ГорбуновА А.,Вахрушев А.В., Симбирцев А.С. 2017.Betts Z., Dickson A.J. Ubiquitous Chromatin Opening Elements (UCOEs) effect on transgene position and expression stability in CHO cells following methotrexate (MTX) amplification. Biotechnol J. 2016; 11(4):554-641.