Problems of Biological Medical and Pharmaceutical ChemistryProblems of Biological Medical and Pharmaceutical ChemistryВопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии1560-95962587-7313Russkiy Vrach Publishing House63734110.29296/25877313-2024-10-10Plant protection and biotechnologyЗащита и биотехнология растенийResearch ArticleIn vitro cell cultures of Ginkgo biloba L., introduced in the moscow region are promising sources of substances with high biological activityКлеточные культуры in vitro Ginkgo biloba L., интродуцированных в Московском регионе, – перспективные источники веществ с высокой биологической активностьюhttps://orcid.org/0000-0001-9137-3774ZaitsevaS. М.ЗайцеваС. М.
Russian Federation

Ph.D. (Biol.), Associate Professor, Department of Biotechnology

к.б.н., доцент, кафедра биотехнологии

smzaytseva@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2655-1789KalashnikovaЕ. А.КалашниковаЕ. А.
Russian Federation

Dr.Sc. (Biol.), Professor, Department of Biotechnology

д.б.н., профессор, кафедра биотехнологии

kalash0407@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5244-4311KirakosyanR. N.КиракосянР. Н.
Russian Federation

Ph.D. (Biol.), Associate Professor, Department of Biotechnology

к.б.н., доцент, кафедра биотехнологии

mia41291@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5952-9211BalakinaА. А.БалакинаА. А.
Russian Federation

Ph.D. (Biol.), Senior Research Scientist, Laboratory of Molecular Biology

к.б.н., ст. науч. сотрудник, лаборатория молекулярной биологии

stasya.balakina@gmail.comRussian State Agrarian University – Moscow Agricultural Academy named after K.A. TimiryazevaРоссийский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. ТимирязеваFederal Research Center for Problems of Chemical Physics and Medical ChemistryФедеральный исследовательский центр проблем химической физики и медицинской химии22102024271067782210202422102024Copyright ©; 2024, Russkiy Vrach Publishing HouseCopyright ©; 2024, ИД "Русский врач"2024Russkiy Vrach Publishing HouseИД "Русский врач"https://journals.eco-vector.com/1560-9596/article/view/637341

Intoduction. Ginkgo biloba (L.) are relict plants characterized by a limited area of growth, the valuable biomass of which is able to accumulate unique secondary metabolites that do not have synthetic analogues. Based on extracts of the leaves of ginkgo biloba, which have a nootropic effect. biologically active additives and medicines are produced – Tanakan, Bilobil, Ginkor gel, etc.. Plants of the genus Ginkgo grow in specialized microecological niches that limit their natural distribution area. It is known that biotic stress is one of the main environmental factors limiting the introduction of valuable plant species – possible sources of production of unique metabolites. Limiting environmental factors have a direct impact on the growth, development and productivity of secondary plant metabolism. Stress-resistant and highly productive plants can be created using cell biotechnology methods, in particular, in vitro cell selection, which is carried out on a callus culture. Therefore, at the first stage, it is necessary to develop in vitro technology for the rapid production of well-proliferating callus tissue with an increased content of secondary metabolites.

Purpose of the study. To study the effect of the vegetation and photoperiod, endogenous polyphenols on the formation of the callus tissue of sequoia (Ginkgo biloba (L.)) in vitro.

Material and methods. The object of the study was Ginkgo biloba (L.) plants. Callus tissue was obtained from segments of leaf blades that were isolated from intact plants. Explants were cultured on WPM nutrient medium containing BAP 2.0 mg/l and 2.0 mg/L 2,4-D. The localization of phenolic compounds was studied in Ginkgo leaves, as well as in callus tissue obtained under different lighting conditions. To do this, histochemical methods were used: for the sum of phenolic compounds, the material was stained with 0.08% Fast Blue reagent raster, a reaction with vanillin reagent in hydrochloric acid vapor was used to study the localization of flavans (catechins and proanthocyanidins).

Results. The intensity of callus tissue formation, its consistency and color were significantly influenced by the growing season and the applied lighting regime. A well-proliferating callus tissue of light yellow color was obtained by cultivation with no light source. At a 16-hour photoperiod, a dark brown callus tissue with green inclusions was formed, the growth of which was inhibited during cultivation. Explants collected in spring and summer had the best proliferative activity. As a rule, the formation of callus tissue occurred in places of minor localization of phenolic compounds. In initiated callus cultures grown in the dark, the content of cells with phenolic compounds was lower than that of callus obtained in the presence of lighting. Extracts of G. biloba L. callus cultures they exhibit low cytotoxicity and can be widely used as a safe raw material for phytopharmacognosy.

Введение. Ginkgo biloba L. – реликтовые растения, характеризующиеся ограниченным ареалом произрастания, ценная биомасса которых способна накапливать уникальные вторичные метаболиты, не имеющие синтетических аналогов. Растения рода Ginkgo произрастают в специализированных микроэкологических нишах, ограничивающих их природный ареал распространения. Создать и интродуцировать стрессоустойчивые, высокопродуктивные растения возможно с использованием методов клеточной биотехнологии, в частности клеточной селекции in vitro. Поэтому важно разработать технологию in vitro быстрого получения хорошо пролиферирующей клеточной культуры с повышенным содержанием вторичных метаболитов.

Цель исследования – изучить влияние вегетационного периода, эндогенных полифенолов на формирование каллусной ткани G. biloba L. in vitro, а также биологическую активность экстрактов клеточных культур этого растения.

Материал и методы. Объектом исследования служили растения G. biloba L. произрастающие в Московском регионе. Каллусную ткань получали из сегментов листовых пластинок, которые изолировали с интактных растений. Экспланты культивировали на питательной среде WPM, содержащей 2,0 мг/л БАП и 2,0 мг/л 2,4-Д. Локализацию фенольных соединений изучали в листьях G. biloba L., а также в каллусной ткани in vitro, выращиваемой при различных режимах освещения. Для этого применяли гистохимические методы: на сумму фенольных соединений материал окрашивали 0,08% раствором реактива Fast Blue, для изучения локализации флаванов (катехины и проантоцианидины) использовали реакцию с ванилиновым реактивом в парах соляной кислоты. Изучение локализации терпеноидов проводили с реактивом НАДИ.

Результаты. На интенсивность образования каллусной ткани, ее консистенцию и цвет существенное влияние оказывал применяемый режим освещения. Хорошо пролиферирующая каллусная ткань светло-жёлтого цвета была получена при культивировании с отсутствием источника освещения. При 16-часовом фотопериоде формировалась каллусная ткань тёмно-бурого цвета с зелёными включениями, рост которой в процессе культивирования был ингибирован. Как правило, формирование каллусной ткани происходило в местах незначительной локализации фенольных соединений. В инициированных каллусных культурах, выращиваемых в темноте, содержание клеток с фенольными соединениями было меньше, чем у каллуса, полученного в присутствии освещения.

Выводы. Каллусные культуры G. biloba L. проявляют низкую цитотоксичность и могут быть широко использованы в качестве безопасного сырья.

Ginkgo biloba L.callus tissuelocalizationpolyphenolsphotoperiodin vitroGinkgoкаллусная тканьсуспензионые культурылокализацияполифенолыфотопериодin vitroThe work was carried out with the support of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation (state assignment No. 124020500019-2).Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ (госзадание № 124020500019-2).Alekseeva G.M., Belodubrovskaya G.A., Blinova K.F. et al. Farmakognoziya. Lekarstvennoe siriyo rastitelnogo i zhivotnogo proiachozhdeniya. Pod red. G.P. Yakovlevoy. Sankt-Petersburg. SpetcLit 2013. (In Russ.).Алексеева Г.М., Белодубровская Г.А., Блинова К.Ф. и др. Фармакогнозия. Лекарственное сырье растительного и животного происхождения. Под редакцией Г.П. Яковлева. Санкт-Петербург: СпецЛит. 2013.Nosov A.M. Regulyatsiya sintesa vtorichnich soedineniy v culture kletok rasteniy. Biologiya kultiviruemich kletok i biotekchnologiya rasteniy. R.G. Butenko (red.). M. Nauka. 1991. (In Russ.).Носов А.М. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений. Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. Под редакцией Р.Г. Бутенко. М.: Наука. 1991.Vasilev V.G., Prokopiev A.S., Kalabin G.A. Identificatciya terpenovikch laktonov i flavanolglikozidov v preparatakch na osnove ekstraktov Ginkgo biloba i noviy sposob polukolichestvennoy ocenki soderzhaniy flavanolglikozidov metodom spektroscopii YMR 1H. Kchimiya rastitelnogo siriya. 2016; 3: 85–93. (In Russ.).Васильев В.Г., Прокопьев А.С., Калабин Г.А. Идентификация терпеновых лактонов и флавоногликозидов в препаратах на основе экстракта гинкго билоба и новый способ полуколичественной оценки содержания флавоногликозидов методом спектроскопии ЯМР 1Н. Химия растительного сырья. 2016; 3: 85–93.Kurkin A.V., Bulankin D.G., Daeva E.D., Kadencev V.I. Flavanoidi listev Ginkgo biloba. Kchimiya rastitelnogo siriya. 2012; 2: 85–88. (In Russ.).Куркин А.В., Буланкин Д.Г., Даева Е.Д., Каденцев В.И. Флавоноиды листьев гинкго двулопастного. Химия растительного сырья. 2012; 2: 85–88.Tukavkina N.A. Bioflavanoidi. M.: Izdatelskiy dom "Russkiy vrach". 2002. 56 c. (In Russ.).Тюкавкина Н.А. Биофлавоноиды. М.: Издательский дом «Русский врач». 2002. 56 с.Kuznetsova S.M., Kuznetsov V.V., Shulzhenko D.V. Primenenie ekstrakta Ginkgo biloba v sisteme reabilitacii bolnich, perenesshikch insult. Mezhdunarodniy nevrologicheskiy zhurnal. 2016; 5(83): 111–114. (In Russ.).Кузнецова С.М., Кузнецов В.В., Шульженко Д.В. Применение экстракта гинкго билоба в системе реабилитации больных, перенесших инсульт. Международный неврологический журнал. 2016; 5(83): 111–114.Katunina E.A. Ginkgo biloba: itogi poluvekovogo opita primeneniya. Polimodalnost effektov Ginkgo biloba: eksperementalnie i klinicheskie issledovaniya. Nevrologiya i revmatologiya. Prilozhenie k zhurnalu Consilium Medicum. – 2013. – № 2. – С. 53–57. 2. (In Russ.).Катунина Е.А. Гинкго билоба: итоги полувекового опыта применения. Полимодальность эффектов гинкго билоба: экспериментальные и клинические исследования. Неврология и ревматология. Приложение к журналу Consilium Medicum. 2013; 2: 53–57. 2.Kalashnikova E.A., Kletochnaya inzheneriya rasteniy. Uchebnik i praktikum dliya vuzov 2-e izdanie. M.: OOO “Izdatelstvo URAIT” 2022. 333s. (In Russ.).Калашникова Е.А. Клеточная инженерия растений. Учебник и практикум для вузов 2-е издание. М.: ООО «Издательство ЮРАЙТ» 2022. 333с.Zaprometov M.N. Fenolnie soedineniya i ikch rol v zhizni rasteniya. LVI Timiryazevskie chteniya. M.: Nauka. 1996. 45 с. (In Russ.).Запрометов М.Н. Фенольные соединения и их роль в жизни растения. LVI Тимирязевские чтения. М.: Наука. 1996. 45 с.Justine Laoué, Catherine Fernandez and Elena Ormeño Plant Flavonoids in Mediterranean Species: A Focus on Flavonols as Protective Metabolites under Climate Stress. Plants. 2022; 11: 172.Justine Laoué, Catherine Fernandez, Elena Ormeño. Plant Flavonoids in Mediterranean Species: A Focus on Flavonols as Protective Metabolites under Climate Stress. Plants. 2022; 11: 172.Xie Y., Xu D., Cui W., Shen W. Mutation of Arabidopsis HY1 causes UV-C hypersensitivity by impairing carotenoid and flavonoid biosynthesis and the down-regulation of antioxidant defence. Journal of Experimental Botany. 2012; 63(10): 3869–3883.Petukchova I.P., Denisov N.I. Opit introdukcii Ginkgo biloba L. na yuge dalnego vostoka Rossii. Vestnik krasnoyarskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2012; 1: 71–75. (In Russ.).Петухова И. П., Денисов Н. И. Опыт интродукции Ginkgo biloba L. На юг дальнего востока России. Вестник красноярского государственного аграрного университета. 2012; 1: 71–75.Nicholas Tuatahi Davies, Hsin-Fu Wu, Clemens Michael Altaner The chemistry and bioactivity of various heartwood extracts from redwood (Sequoia sempervirens) against two species of fungi. New Zealand Journal of Forestry Science. 2014; 044, Articenumber: 17.Volinets A.P. Fenolnie soedineniya v zhizni rasteniy. Minsk: Belarus. Navyka. 2013; 283 с. (In Russ.).Волынец А.П. Фенольные соединения в жизнедеятельности растений. Минск: Беларус. Навука. 2013; 283 с.Szewczyk A., Kwiecień I., Grabowski M. et al. Phenylalanine Increases the Production of Antioxidant Phenolic Acids in Ginkgo biloba Cell Cultures. Molecules. 2021; 26: 4965.Szewczyk A., Kwiecień I.; Grabowski M. et al. Phenylalanine Increases the Production of Antioxidant Phenolic Acids in Ginkgo biloba Cell Cultures. Molecules. 2021; 26: 4965.Nosov A.M. Ispolzovanie kletochnikch tekchnologiy dliya promishlennogo polucheniya biologicheski aktivnikch veshestv rastitelnogo proiskchozhdeniya. Biotechnology. 2010; 5: 8–28. (In Russ.).Носов А.М. Использование клеточных технологий для промышленного получения биологически активных веществ растительного происхождения. Биотехнология. 2010. 5: 8–28.Qingjie Wang, Yang Jiang, Xinyu Mao et al. Integration of morphological, physiological, cytological, metabolome and transcriptome analyses reveal age inhibited accumulation of flavonoid biosynthesis in Ginkgo biloba leaves. Industrial Crops and Products. 2022; 187(Part B): 115405.Qingjie Wang, Yang Jiang, Xinyu Mao et al. Integration of morphological, physiological, cytological, metabolome and transcriptome analyses reveal age inhibited accumulation of flavonoid biosynthesis in Ginkgo biloba leaves. Industrial Crops and Products. 2022; 187(Part B, 1): 115405.Teplitskaya L.M., Chmeleva S.I., Buraga I.A., Buraga A.M. Osobennosti kallusogeneza v culture Ginkgo biloba L. Bulleten Nikitskogo botanicheskogo sada. 2010; vipusk 101. (In Russ.).Теплицкая Л.М., Чмелева С.И., Бурага И.А., Бурага А.М. Особенности каллусогенеза в культуре Ginkgo biloba L. Никитского ботанического сада. 2010; 101.McCown B.H., Lloyd G. Woody Plant Medium (WPM) – A Mineral Nutrient Formulation for Microculture of Woody Plant Species. HortScience. 1981; 16: 453-453.Soukupova J., Cvikrova M., Albrechtova J. et al. Histochemical and Biochemical Approaches to the Study of Phenolic Compounds and Peroxidases in Needles of Norway Spruce (Picea abies). New Phytol. 2000; 146: 403–414.Babushkina E.V., Smirnov P.D., Kostina O.V. i dr. Gistochimiya trikchom oficinalnikch predstaviteley semeystva Lamiaceae. Medicinskiy almanac. 2017; 3(48). (In Russ.).Бабушкина Е.В., Смирнов П.Д., Костина О.В. и др. Гистохимия трихом официнальных представителей семейства Lamiaceae. Медицинский альманах. 2017; 3(48).Lakin G.F. Biometriya: ucheb. posobie dliya boil. spets. vuzov. M.: Visshaya shkola. 1990; 352 с. (In Russ.).Лакин Г.Ф. Биометрия: учеб. пособие для биол. спец. вузов. М.: Высшая школа. 1990. 352 с.Zaytseva S.M., Kalashnikova E.A., Kirakosiyan R.N. Vliyanie enogennikch polifenolov, fotoperioda I mineralnogo sostava pitatelnoy sredi na formirovanie kallusnoy tkani reliktovikch golosemennikch rasteniy Sequoia sempervirens L. Voprosi biologicheskoy, farmatsevticheskoy i meditsinskoy kchimii. 2023; 26(3): 46–57. (In Russ.).Зайцева С.М., Калашникова Е.А., Киракосян Р.Н. Влияние эндогенных полифенолов, фотопериода и минерального состава питательной среды на формирование каллусной ткани реликтовых голосеменных растений Sequoia sempervirens L. Вопросы биологической, фармацевтической и медицинской химии. 2023; 26(3): 46–57.Horbowicz M., Wiczkowski W., Góraj-Koniarska J. et al. Effect of Methyl Jasmonate on the Terpene Trilactones, Flavonoids, and Phenolic Acids in Ginkgo biloba L. Leaves: Relevance to Leaf Senescence. Molecules. 2021 Aug 2; 26(15): 4682. DOI: 10.3390/molecules26154682.Timashova L.V., Matsneva O.V., Shakchova V.V., Kchrova T.M. Osobennosty pervogo etapa klonalnogo mikrorazmnozheniya immunnikch sortov yablony. Sovremennoye sadovodstvo – Contemporary horticulture. 2018; 3: 114–121. DOI: 10.24411/2312-6701-2018-10315. (In Russ.).Ташматова Л.В., Мацнева О.В., Шахов В.В., Хромова Т.М. Особенности первого этапа клонального микроразмножения иммунных сортов яблони. Современное садоводство – Contemporary horticulture. 2018; 3: 114–121. DOI: 10.24411/2312-6701-2018-10315.Bulankin D.G., Zhirnova A.I., Kurkin A.V. et al. Anatomo-morfologicheskoe issledovanie listev ginkgo bilobo. Meditsinskiy Almanach. 2011; 6: 249–252. (In Russ.).Буланкин Д.Г., Жирнова А.И., Куркин В.А. и др. Анатомо-морфологическое исследование листьев гинкго двулопастного. Медицинский альманах. 2011; 6: 249–252.Tomilova S.V., Globa E.B., Demidova E.V., Nosov A.M. Vtorichniy metabolism v culture in vitro Taxus spp. Fisiologiya rasteniy. 2023; 70(3): 227–240. (In Russ.).Томилова С.В., Глоба Е.Б., Демидова Е.В., Носов А.М. Вторичный метаболизм в культуре клеток in vitro Taxus spp. Физиология растений. 2023; 70(3): 227–240.Dubravina G.A., Zaytseva S.M., Zagoskina N.V. Ismeneniya v obrazovanii i lokalisastii fenolnikch soedineniy pri dedifferentsiatsii tkaney tissa yagodnogo I tissa kanadskogo v usloviyach in vitro. Fisiologiya rasteniy 2005; 52: 755–762. (In Russ.).Дубравина Г.А., Зайцева С.М., Загоскина Н.В. Изменения в образовании и локализации фенольных соединений при дедифференциации тканей тисса ягодного и тисса канадского в условиях in vitro. Физиология растений. 2005; 52: 755–762.Saslowsky D.E., Warek U., Winkel B.S.J. Nuclear localization of flavonoid enzymes in Arabidopsis. Journal of Biological Chemistry. 2005; 280(I. 25): 23735–23740. (In Russ.).Saslowsky D.E., Warek U., Winkel B.S.J. Nuclear localization of flavonoid enzymes in Arabidopsis. Journal of Biological Chemistry. 2005; 280(I. 25): 23735–23740.Beibei Zhao, Li Wang, Siyu Pang et al. UV-B promotes flavonoid synthesis in Ginkgo biloba leaves. Industrial Crops and Products. 2020; 151: 112483.Yuan Z., Tian Y., He F. et al. Endophytes from Ginkgo biloba and their secondary metabolites. Chin Med. 2019; 14(51); https://doi.org/10.1186/s13020-019-0271-8.Yuan Z., Tian, Y., He, F. et al. Endophytes from Ginkgo biloba and their secondary metabolites. Chin Med. 2019; 14(51); https://doi.org/10.1186/s13020-019-0271-8.