Interoduction. The present work extends the understanding of the activity of ouabain-sensitive (α2 and α3) and ouabain-resistant (α1) Na+/K+-ATPase isoforms in the mixed membrane fraction of rat cerebral cortex in the presence of various detergents.
The aim of the study: to determine the activity of ouabain-sensitive (α2 and α3) and ouabain-resistant (α1) Na+/K+-ATPase isoforms by changing the concentration of Mg+2 ions in the incubation medium and using the detergents sodium deoxycholate and Tween-20.
Material and methods. To determine Na+/K+-ATPase activity, we used the method of A. Kazennova et al. The reaction was triggered by adding homogenate of cerebral cortex incubated with detergents; the samples were incubated for 30 minutes in a water bath at 370 C. The activity of ouabain-sensitive isoforms was determined by adding 200 μmol of ouabain to the incubation mixture. The activity of ouabain-sensitive isoforms was determined by adding 200 μmol ouabain to the incubation mixture, and the activity of ouabain-resistant isoforms was determined as the difference between the total Na+/K+-ATPase activity and the activity of ouabain-sensitive isoforms. ATPase activity was determined by inorganic phosphate (Pi) increment as the difference between total ATPase activity, magnesium ATPase activity, in reaction with ammonium molybdate and tin chloride in the presence of ascorbic acid as a reducing agent.
Results. At optimal concentrations of detergents Dox-Na (1.25 mg/mL) and Tween-20 (6.5 mg/mL), both ouabain-sensitive and ouabain-resistant Na+/K+-ATPase isoforms are characterized by normal activity dynamics from the concentration of Mg2+ ions. Consequently, the use of detergents at given concentrations does not change the ability of enzymes to conformational rearrangements during the reaction cycle.
It was found that both used detergents allow to reveal a significant percentage of latent activity of ouabain-sensitive (α2 and α3) and ouabain-resistant (α1) Na+/K+-ATPase isoforms in the mixed mebran fraction of the cerebral cortex of rats.
Conclusion. The study of Mg2+-dependent properties revealed a similar character of the curves of dependence of enzyme activity on the concentration of Mg2+ in the incubation medium for all Na+/K+-ATPase isoforms studied
Введение. Настоящая работа расширяет представления об активности уабаин-чувствительных (α2 и α3) и уабаин-резистентной (α1) изоформ Na+/K+-АТФазы в смешанной мембранной фракции коры больших полушарий головного мозга крыс в присутствии различных детергентов.
Цель исследования – определить активность уабаин-чувствительных (α2 и α3) и уабаин-резистентной (α1) изоформ Na+/K+-АТФазы с помощью изменения концентрации ионов Mg+2 в инкубационной среде и при использовании детергентов дезоксихолата натрия и Твин-20.
Материал и методы. Для определения активности Na+/K+-АТФазы использовали методику А. Казеннова и соавт. Реакцию запускали добавлением инкубированного с детергентами гомогената коры больших полушарий, образцы инкубировали в течение 30 мин на водяной бане при температуре 37 0С. Активность уабаин-чувствительных изоформ определяли при добавлении в инкубационную смесь 200 мкмоль уабаина, а активность уабаин-резистентных изоформ – как разницу между общей активностью Na+/K+-АТФазы и активностью уабаин-чувствительных изоформ. Активность АТФаз выявляли по приросту неорганического фосфата, как разницу между общей АТФазной активностью, активностью магниевой АТФазы, в реакции с молибдатом аммония и хлоридом олова в присутствии аскорбиновой кислоты в качестве восстановителя.
Результаты. При оптимальных концентрациях детергентов Dox-Na (1,25 мг/мл), Твин-20 (6,5 мг/мл), как для уабаин-чувсвительных, так и для уабаин-резистентных изоформ Na+/K+-АТФазы, характерна нормальная динамика активности от концентрации ионов Mg2+. Следовательно, использование детергентов в заданных концентрациях не изменяет способности ферментов к конформационным перестройкам в ходе реакционного цикла. Установлено, что оба использованных детергента позволяют выявить существенный процент латентной активности уабаин-чувствительных (α2 и α3) и уабаин-резистентной (α1) изоформ Na+/K+-АТФазы в смешанной мебранной фракции коры больших полушарий головного мозга крыс.
Выводы. Исследование Mg2+-зависимых свойств выявило сходный характер кривых зависимости активности фермента от концентрации Mg2+ в инкубационной среде для всех исследованных изоформ Na+/K+-АТФазы.