Increased α-synuclein and tyrosine hydroxylase mRNA expression in the midbrain in experimental model of alcohol consumption during adolescence)

Full Text

Обоснование

Данные экспериментальных исследований показывают, что длительное потребление алкоголя приводит к нарушению структуры и функций нервных клеток, клеточной гибели, подавлению процесса нейрогенеза в мозге, уменьшению объема мозговой ткани, особенно фронтальной области коры, атрофии белого вещества и увеличению объема желудочков [1, 2]. Модель потребления больших количеств алкоголя в течение короткого периода времени («запойное» употребление, “binge drinking”) среди подростков считается одним из факторов риска развития расстройств, связанных с употреблением алкоголя, в том числе когнитивных нарушений, в более позднем возрасте [3]. Такая модель потребления может быть отчасти обусловлено специфической для подростков чувствительностью к эффектам алкоголя и склонностью к рискованному поведению [4] и связана с серьезным вредом, таким как отравление алкоголем, травмы и несчастные случаи в результате острой интоксикации [5].

Учитывая процесс продолжающегося развития мозга в подростковом возрасте [6, 7], можно полагать, что чрезмерное употребление алкоголя может привести к долговременным изменениям в нейронах. Клинические исследовании подростков показали, что чрезмерное употребление алкоголя связано с нарушением нейропсихологических функций [8, 9, 10] и отклонениями в структуре и функционировании мозга [11, 12, 13]. Важно отметить, что именно модель «запоя» (т. е. употребление пяти или более порций единовременно) была связана с неблагоприятным воздействием на функционирование мозга у молодых людей [14, 15]. Обратимость эффектов чрезмерного употребления алкоголя подростками на структуру и функции мозга при устойчивом воздержании требует дальнейшего изучения [8] и входит в задачи крупных многоцентровых исследований, таких как Национальный консорциум по алкоголю и развитию нервной системы в подростковом возрасте [16], исследование IMAGEN в Европе [17].

В экспериментальных исследованиях на грызунах установлено, что эффекты употребления алкоголя в подростковом возрасте на мозг и нейрокогнитивные функции могут зависеть от времени, дозы и периодичности воздействия алкоголя [18, 19, 20]. Эксперименты показывают, что употребление алкоголя в подростковом возрасте может оказывать опосредованное воздействие на когнитивные функции и поведение посредством эпигенетических механизмов [21, 22]. Вместе с тем конкретные механизмы отставленных эффектов алкоголя в период полового созревания до сих пор мало изучены.

Нарушение функций синуклеинов, эволюционно консервативных нейрональных белков, связанных с мембраной синаптических везикул и участвующих в контроле их транспорта к пресинаптической терминали, приводит к образованию гистопатологических включений в нейронах и является одним из ключевых факторов патогенеза ряда нейродегенеративных заболеваний [23]. В локусе гена SNCA человека были выявлены мутации, ассоциированные с высоким уровнем потребления алкоголя, однако роль этих белков в формировании алкогольной зависимости, а также в механизмах нейродегенеративных процессов при действии алкоголя до сих пор остаётся невыясненной [24]. Неясно, являются ли изменения экспрессии SNCA на определенных этапах формирования алкогольной зависимости нейроадаптивной реакцией, либо, напротив, одним из ключевых звеньев патогенеза, и, соответственно, могут ли они быть мишенью направленной фармакотерапии. Неясно, является ли активация экспрессии синуклеинов и образование протофибриллярных форм, обладающих токсическим эффектом, причиной нейродегенеративных процессов при алкогольной интоксикации в критические периоды развития. Отсутствуют также данные о критических периодах в индивидуальном развитии, характеризующихся повышенным риском стойких нарушений экспрессии синуклеинов в мозге. Можно предположить, что основным локусом этих нарушений является средний мозг - центр локализации тел дофаминовых нейронов [25].  Нарушение функционального состояния пресинаптических окончаний нейронов среднего мозга лежит в основе целого ряда синуклеинопатий [26]. Очевидна важность взаимодействия процессов, обеспечивающих синтез дофамина, его хранение, высвобождение, обратный захват и катаболизм. Молекулярные механизмы регуляции синуклеинами процессов везикулярного транспорта в этой области мозга, как мы предполагаем, играют важную роль в координации работы всей системы, а их нарушения – в механизмах дисфункции дофаминовой системы и гибели дофаминергических нейронов.

Цель исследования

Целью настоящего исследования было изучение отставленного эффекта алкоголя в адолесцентном периоде на экспрессию мРНК нейрональных белков синуклеинов в мозге, нарушение функций которых считается одним из ключевых факторов патогенеза ряда нейродегенеративных заболеваний. В статье представлены результаты анализа: 1) экспрессии мРНК SNCA в среднем мозге, стриатуме, миндалине и гипоталамусе крыс в экспериментальной модели алкоголизации в адолесцентном периоде и 2) анализ уровня мРНК функционально связанных с α-синуклеином везикулярных белков SNARE-комплекса и дофамин-ассоциированных генов, кодирующих фермент синтеза дофамина – ТН,  рецептор дофамина D2 и DAT в среднем мозге.

Методы

Дизайн исследования

Эксперименты проводились на крысах – самцах Wistar (питомник лабораторных животных «Столбовая»). Животных содержали по 8 крыс в одной клетке (тип: Т/4В Код: 555/4), в условиях естественной освещенности при температуре 22±2°C и свободном доступе к пище и воде. В качестве пищевого рациона на всех этапах работы использовался гранулированный корм (ГОСТ Р 50258-92). Средняя масса животных в начале эксперимента (30-й день жизни) составила 80±5,6 г. C 30-го по 40-й дни жизни крысы опытной группы получали внутрибрюшинные инъекции этанола (20% в физиологическом растворе) в дозе 3 г/кг (Рис.1). Животные контрольной группы получали инъекции физиологического раствора соответствующего объема. В возрасте 58 дней животных декапитировали и выделили структуры мозга [27]. Образцы хранили при -70^оС.

Рис.1. Схема эксперимента

C 30-го по 40-й дни жизни крысы опытной группы (Alc) получали внутрибрюшинные инъекции этанола (20% в физиологическом растворе) в дозе 3 г/кг. Животные контрольной группы (C) получали инъекции физиологического раствора. В возрасте 58 дней животных декапитировали и выделили структуры мозга.

Относительный уровень транскриптов изучаемых генов анализировали методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени после обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). Для выделения тотальной РНК использовали набор «RNeasy Lipid Tissue MiniKit» (QIAGEN), для синтеза кДНК – набор «Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit» (Fermentas) согласно инструкциям производителей. Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для количественной ПЦР в режиме реального времени на амплификаторе CFX96 Real-Time System C1000 Thermal Cycler ("Bio-Rad", США) (BioRad, Германия). Для нормализации данных в качестве референсного был выбран ген β-актина. Для подбора праймеров использовали оn-line ресурс Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Последовательности олигонуклеотидных праймеров (ДНК-синтез, Россия) представлены в Таблице 1.

 

 

Амплификацию проводили в 25 мкл смеси, содержащей 25 нг матрицы (кДНК), праймеры в конечной концентрации 0,4 мкМ и 5 мкл 5х реакционной смеси qPCRmix-HS SYBR с интеркалирующим красителем SYBR Green I (Евроген, Россия). В качестве отрицательного контроля служили пробы, содержащие вместо кДНК соответствующий объем воды. Программа амплификации включала: 95°С – 3 мин; 40 циклов: 95°С, 15 сек, 60°С,15 сек, 72°С, 30 сек с последующим анализом кривых плавления полученных ПЦР-продуктов. Измерения проводили не менее чем в 3 параллельных образцах. Расчет относительной экспрессии проводили на основании сравнительной оценки величин Сt (threshold cycle). Для сравнения уровней экспрессии интересующих генов в опыте и контроле использовали метод 2^-ΔΔСt. Контроль целостности выделенной РНК и специфичности полученного в результате ОТ-ПЦР продукта осуществляли при помощи электрофореза в 2% агарозном геле на 1хТАЕ буфере. Для визуализации результатов использовали трансиллюминатор (UVC Inc., USA) и систему гель-документирования (Gel Imager-2, Helicon, Россия).

 

Статистические методы

Статистические расчеты производили с помощью программного пакета Statistica v.12 («Statsoft», США). Для оценки формы распределения данных в выборках использовали критерий Шапиро-Уилка. Однородность дисперсий оценивали критерием Фишера. Так как результаты подчинялись Гауссову распределению и гомоскедастичность была подтверждена, использовали параметрические методы анализа. Сравнение средних значений выборок проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверными считали отличия при уровне значимости р<0,05. Графическое представление данных осуществляли в среде программирования Python v.3.11, используя библиотеки matplotlib v.3.10.0 и seaborn v.0.13.2 с отрытым исходным кодом.

Результаты

Сравнительный анализ уровня мРНК SNCA в структурах мозга крысы – среднем мозге, стриатуме, миндалевидном теле и гипоталамусе выявил достоверное увеличение экспрессии мРНК в среднем мозге – на 46,8% (t=2,26; p=0,044) и стриатуме – на 56% (t=2,63; p=0,023) алкоголизированных в адолесцентном периоде крыс по сравнению с контрольной группой (Рис.2).

 

Рис.2. Сравнительный анализ уровня мРНК SNCA (SNCA) в морфологических структурах мозга крыс.

С – контрольная группа крыс, n=6; Alc – группа алкоголизированных в адолесцентном периоде крыс, n=7. По оси OX: MB – средний мозг, ST – стриатум, AMY – миндалевидное тело, HYP – гипоталамус. Линией, параллельной оси OX, отмечено среднее значение выборки, барами – стандартное отклонение. Звёздочкой (*) отмечены статистически значимые отличия между группами: * – р<0,05 (t-критерий Стьюдента).

 

Изучение уровня мРНК функционально связанных с α-синуклеином везикулярных белков SNARE-комплекса и дофамин-ассоциированных генов (ТН, D2, DAT) в среднем мозге показало повышение уровня мРНК TH – на 54% (t=2,7; p=0,021) у алкоголизированных крыс по сравнению с контрольной группой при неизмененном уровне мРНК γ-синуклеина, SNAP25, VAMP2, D2-рецептора и DAT (Рис.3)

 

Рис.3. Сравнительный анализ уровня мРНК везикулярных белков SNARE-комплекса и дофамин-ассоциированных генов в среднем мозге крыс.

С – контрольная группа крыс, n=6; Alc – группа алкоголизированных в адолесцентном периоде крыс, n=7. По оси OX: SNCG - γ-синуклеин, TH - тирозингидроксилаза, DAT - транспортер дофамина, D2 -дофаминовый рецептор второго подтипа, SNAP25 - ассоциированный с синаптосомами белок 25 кДа,  VAMP2 - синаптобревин-2. Линией, параллельной оси OX, отмечено среднее значение выборки, барами – стандартное отклонение. Звёздочкой (*) отмечены статистически значимые отличия между группами: * – р<0,05 (t-критерий Стьюдента).

Обсуждение

Резюме результатов исследования

Показано повышение уровня мРНК SNCA в стриатуме и среднем мозге алкоголизированных в адолесцентном периоде животных.  Анализ экспрессии мРНК функционально связанных с синуклеином везикулярных белков SNARE-комплекса и дофамин-ассоциированных генов показал повышение уровня мРНК TH у алкоголизированных крыс по сравнению с контрольной группой при неизмененном уровне мРНК γ-синуклеина, SNAP25, VAMP2, дофаминового D2-рецептора и DAT.

Интерпретация результатов исследования

Синаптическоий белок α-синуклеин в дофаминовой системе принимает участие не только в процессе везикулярного транспорта, но и, согласно данным литературы, в механизмах внутриклеточной модуляции различных звеньев дофаминовой нейротрансмиссии [28, 29]. Полученные данные не противоречат существующей гипотезе о том, что оверэкспрессия SNCA может быть одним из факторов предрасположенности к алкоголизму [30]. Вместе с тем, исследования показывают [30], что при определенных условиях, например, при дефиците белка-шаперона CSPα (chaperone cysteine string protein α) α-синуклеин может брать на себя функции шаперона, регулирующего транспорт синаптических везикул SNARE-комплекса, по-видимому, путем прямого взаимодействия с одним из его компонентов – белком VAMP2 [29]. Важно, что эта функция α-синуклеина особенно актуальна в условиях чрезмерной активации дофаминовой нейротрансмиссии, например, при действии психоактивных веществ или дисфункции системы при старении. Последствия роста содержания α-синуклеина для нейрона могут быть двоякими. Рост содержания этого белка является характерной чертой патогенеза нарушений, вызванных черепно-мозговой травмой, однако его роль окончательно не установлена [31]. С одной стороны, было показано, что оверэкспрессия SNCA оказывает негативное влияние на выживаемость и развитие дендритов новорожденных нейронов [32]. С другой стороны, установлено, что α-синуклеин участвует в удлинении главного аксона и коллатералей, что приводит к более высокой плотности аксонов в дорсальном стриатуме [33]. Несмотря на то, что содержание α-синуклеина повышается во время апоптотической гибели клеток в стриатуме, авторы полагают, что эти изменения могут быть частью компенсаторного ответа в нейронах, которым суждено выжить [34]. Действительно, несколько исследований показали его важную роль в созревании и модуляции синапсов, а также в регуляции пластических и регенеративных процессов при повреждении нейронов [35, 36]. Мы обнаружили увеличение экспрессии мРНК ТН в среднем мозге крыс, алкоголизированных в подростковом возрасте. ТН катализирует первый и лимитирующий скорость этап биосинтеза дофамина. Ранее сообщалось, что повышенная регуляция уровня ТН является отличительным признаком биохимической адаптации к хроническому воздействию психоактивных веществ, включая этанол [37]. Вместе с тем, острое введение этанола также приводит к усилению экспрессии и содержания TH у рыб Danio rerio [38]. Исследование влияния повышенной экспрессии ТН у мутантных мышей ТН S40E (S40E-TH) на метаболизм дофамина и реактивность к метамфетамину (МЕТН) показало, что скорость оборота дофамина в нервных окончаниях была увеличена [40]. При этом, у мышей, экспрессирующих S40E-TH, стереотипное поведение наблюдалось при введении более низких доз МЕТН, чем у контрольных животных. Эти данные показали, что активность и уровень экспрессии TH являются одним из определяющих факторов чувствительности и реактивности к МЕТН [39].Алкогольная зависимость — сложное расстройство, которое часто начинается с эпизодов чрезмерного употребления алкоголя в подростковом возрасте. Когнитивная импульсивность – особенность личности, которая может подготовить почву для перехода к алкогольной зависимости, по мнению некоторых авторов, может быть ассоциирована с высокой экспрессией ТН в дофаминергических нейронах мозга [41].  Было показано, что предпочитающие алкоголь крысы (линия P), отличающиеся высокой импульсивностью от крыс дикого типа, имеют высокий уровень экспрессии ТН в вентральной области покрышки [40]. Авторы считают, что это может быть связано с повышенным уровнем нейронального сигнала Toll-подобного рецептора 4 (TLR4) в среднем мозге [40].  Действительно, TLR4 локализуется в дофаминергических (TH+) нейронах VTA и влияет на экспрессию TH через сигнальный путь, включающий активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы A (PKA) и фосфорилирование и активацию транскрипционного фактора CREB [40]. Авторы считают, что именно TLR4-зависимое повышение экспрессии TH, вероятно, способствует инициации употребления алкоголя и переходу к алкогольной зависимости [40]. В данном случае, речь идет о врожденных особенностях нейрохимической организации мозга. С использованием дофаминергической клеточной линии SH-SY5Y был раскрыт ещё один вероятный молекулярный механизм этанол-вызванной оверэкспрессии TH: было показано, что активация цАМФ/PKA пути ассоциирована с этанол-вызванной оверэкспрессией TH, которая нормализуется при добавлении к среде глиального нейротрофического фактора [41]. В нашей работе показано, что повышенный уровень экспрессии ТН в среднем мозге может быть связан с ранним употреблением алкоголя в критические периоды развития, в частности, в адолесцентном периоде, что предполагает эпигенетический механизм данных нарушений. Безусловным ограничением нашего исследования является отсутствие показателей количественной оценки уровня и активности ТН.  Так, учитывая существующие данные о функциональном взаимодействии между α-синуклеином и TH, при котором первый регулирует синтез дофамина путем снижения фосфорилирования TH и ее ферментативной активности [42] можно с осторожностью предположить компенсаторную природу увеличения экспрессии мРНК ТН.

В настоящее время неясно, связаны ли наблюдаемые нами изменения экспрессии SNCA и TH с когнитивными нарушениями, возникающими при злоупотреблении алкоголем. Исследования на людях указывают на роль белка α-синуклеина и гена SNCA в развитии болезни Альцгеймера, хотя результаты не однозначны. Болезнь Альцгеймера связана с участком хромосомы 4q, включающим ген SNCA [43]. Исследования продемонстрировали связь между болезнью Альцгеймера и более длинными аллелями (повторы в полиморфном локусе, расположенном на 9 кб выше SNCA, который регулирует экспрессию α-синуклеина [43]. Дофаминергические проекции к подкорковым (стриатум, миндалевидное тело, таламус) и корковым структурам играют важную роль в регуляции обучения и памяти при формировании зависимости с помощью вознаграждения, удовольствия, мотивации, обусловленного поиска психоактивного вещества, формирования привычек и принятия решений. Показана роль α-синуклеина в развитии тревожности при алкогольной зависимости [44]. Результаты исследований продемонстрировали снижение как потребления этанола, так и предпочтения к нему, а также отсутствие чувствительности к анксиолитическому эффекту этанола у мышей с мутацией гена SNCA [44]. Анализ влияния 3-х однонуклеотидных полиморфизмов SNCA (rs356200, rs356219 и rs2119787) на симптомы тревоги у 128 пациентов с зависимостью от алкоголя выявили ассоциацию rs356219 с высоким уровнем тревожности [44].  Открытым остается вопрос о связи повышенного уровня мРНК SNCA и белка в периферической крови с тягой к алкоголю у больных алкоголизмом [45]. Оценка экспрессии мРНК в периферической крови у нечеловекообразных приматов – Macaca fascicularis, употреблявших этанол в течение 18 месяцев показала, что уровень мРНК SNCA в периферической крови был значительно выше (в 3,21 раза), чем у контрольной группы, не употреблявшей алкоголь. Эти данные подтверждают концепцию связи между α-синуклеином и алкоголизмом, и демонстрируют возможность его использования в качестве биомаркера потребления этанола у крыс, обезьян и людей. Однако механизмы участия α-синуклеина в нарушении процессов обучения и памяти и аффективного состояния при злоупотреблении алкоголем в настоящее время практически не изучено. Будущие исследования будут направлены на поиск ответов на эти вопросы.

Ограничения исследования

В данной работе мы анализировали экспрессию мРНК, но не проводили количественную оценку уровня белка α-синуклеина, а также содержания и активности ТН, в связи с чем необходимо с осторожностью относиться к интерпретации данных.

В исследовании были использованы только самцы крыс, что не позволяет с уверенностью экстраполировать полученные данные на оба пола.

Мы использовали инъекционный способ введения алкоголя в целях стандартизации дозы и времени воздействия, вместе с тем, необходимы дальнейшие исследования с использованием моделей добровольного (полупринудительного) потребления алкоголя.

Изменения уровня мРНК оценивали только в одной точке – на 58-й день жизни, что не позволяет обсуждать динамику изучаемых показателей до наступления половозрелости (PND 40-58) и после.

Дополнительные поведенческие эксперименты необходимы для валидации полного спектра долговременных когнитивных и аффективных нарушений, связанных с алкогольной интоксикацией в подростковом возрасте.

Заключение

В работе получены новые данные об увеличении экспрессии мРНК SNCA и ТН в среднем мозге крыс с интоксикацией алкоголем в адолесцентном периоде, что представляется первым доказательством потенциальной роли α-синуклеина в регуляции долговременных адаптивных изменений дофаминовой нейротрансмиссии при действии алкоголя в этот критический период постнатального развития. Полученные данные позволяют расширить знания о возможных механизмах изменений в структурах мезолимбической системы мозга на уровне регуляции транскрипции генов синаптических белков, которые могут рассматриваться в качестве потенциальной мишени для направленной профилактики и терапии алкоголь-ассоциированных нарушений функций мозга.

 

About the authors

Viktor Kokhan

«V.P. Serbsky National Medical Research Center of Psychiatry and Narcology, Moscow, Russia

Email: kohan.v@serbsky.ru
ORCID iD: 0000-0002-5512-4356
SPIN-code: 5357-4984
Scopus Author ID: 37087305800
ResearcherId: E-9478-2017

PhD, Senior Researcher at the Laboratory of Psychopharmacology,

Department of Fundamental and Applied Neurobiology

Russian Federation

Inna Shamakina

V.P. Serbsky National Medical Research Center of Psychiatry and Narcology

Author for correspondence.
Email: shamakina@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0001-9037-3932
SPIN-code: 9729-1573
Scopus Author ID: 6602799346

MD, Cand. Sci. (Biology)

Head of the Psychopharmacology Laboratory, Department of Fundamental and Applied Neurobiology

Russian Federation

Petr Anokhin

«V.P. Serbsky National Medical Research Center of Psychiatry and Narcology, Moscow, Russia

Email: petranokhin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7974-5077
SPIN-code: 3105-4984
Scopus Author ID: 56252492300

PhD, Senior Researcher at the Laboratory of Psychopharmacology Department of Fundamental and Applied Neurobiology

Russian Federation

References

Supplementary files