DEVELOPING A SENSOR SYSTEM FOR IDENTIFICATION OF POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS AS ENVIRONMENTAL TOXICANTS IN AQUEOUS AND PROTEIN MEDIA

Full Text

К началу XXI века мировая экологическая обстановка не имеет тенденции к стабилизации, что связано с развитием транспорта, усиленной химизацией производства, накоплением токсических продуктов антропогенного происхождения. В настоящее время в результате хозяйственной деятельности в биосфере циркулирует большое число различных соединений, многие из которых имеют высокую токсичность и приводят к серьезным, часто необратимым нарушениям в организме [9, 14]. К таким веществам относятся 21 полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) [4]. С учетом канцерогенных и мутагенных свойств данных веществ, их способности накапливаться в организме, связываться с белками и влиять на их структуру, вызывая различные заболевания, оказывать вредное влияние даже в сравнительно низких концентрациях [11] эти химические загрязнители должны быть отнесены к числу приоритетных, мониторинг содержания которых в различных средах обязателен. Окружающая среда Экология человека 2019.05 Нужно отметить, что в живом организме большинство метаболических реакций осуществляются при непосредственном участии белковых макромолекул. При этом белковые макромолекулы способны претерпевать структурные перестройки под действием различных факторов и агентов [2]. Изучение белков как основного составного элемента живой природы, а также влияния внешних факторов на белковые системы представляет собой одну из наиболее актуальных проблем науки. В условиях современной жизни особенно интересным представляется изучение неизбежного влияния на эти системы различных отрицательных факторов и токсических воздействий, среди которых особое внимание следует уделить ПАУ. Установление биомолекулярных механизмов, подверженных влиянию экотоксикантов, позволяет определять показатели, изменение которых в биологических средах организма даёт возможность более точно и в более ранние сроки обнаружить предпатологические состояния, возникшие в результате неблагоприятного воздействия факторов среды обитания, в том числе воздействия ПАУ. В связи с этим актуальной для современной науки является разработка эффективных методов определения данных экотоксикантов для своевременного и достоверного проведения контроля качества среды и выявления структурных изменений биомолекул для целей ранней диагностики заболеваний. Перспективными для этих целей являются люминесцентные методы [4]. В последние годы данные методы широко используются в аналитической химии и биохимических исследованиях, в клинической диагностике и для осуществления контроля за загрязнением объектов окружающей среды [1]. Это связано с рядом их достоинств: высокой чувствительностью определения, возможностью автоматизации процедур пробоподготовки и детекции, простотой и экспрессностью анализа. Одним из вариантов люминесцентного метода является метод тушения флуоресценции [3, 10, 12, 13]. В литературных источниках показаны возможности использования тушения флуоресценции не только в различных биохимических исследованиях, но и в аналитической химии. Выход флуоресценции очень чувствителен к различным внутри- и межмо-лекулярным взаимодействиям, которые вызывают уменьшение эмиссии флуорофоров. Исследование собственной флуоресценции биологических материалов не всегда позволяет получить желаемую информацию об объекте. В таком случае используют люминесцентные зонды [8]. С помощью люминесцентных зондов можно исследовать молекулярные механизмы возникновения и развития патологических процессов, действие на организм биологически активных веществ и лекарственных препаратов. Люминесцентные зонды применяются также для диагностики и прогноза развития заболеваний, выявления факторов риска и контроля эффективности лечения. Зондовая люминесценция чувствительна к структурно-функциональным изменениям в био логических мембранах, микровязкости ее липидного бислоя, связыванию с белками и другими веществами, структурным перестройкам в белках, изменению мембранного потенциала и др. [1]. Исследование флуоресценции зонда позволяет установить его доступность, локализацию в белках и мембранах клеток, их проницаемость для тушителей, скорость диффузии. В качестве таких люминесцентных зондов могут с успехом применятся ПАУ, поскольку они обладают собственной флуоресценцией и способны связываться с белками. Таким образом, целью нашей работы являлось исследование возможности определения ПАУ в водных и белковых средах с использованием люминесцентной сенсорной системы на основе сывороточных альбуминов. Методы Работа относится к экспериментальным исследованиям. В ней использовались растворы бычьего сывороточного альбумина - БСА и сывороточного альбумина человека - САЧ (фирма «Sigma», США, c содержанием 99 % основного вещества) с концентрацией 1 мг/мл в фосфатном буфере (рН 7,4). Эти белки являются наиболее распространенными в организмах, выполняют важные физиологические функции, играют важную роль в связывании и транспортировании различных веществ [7], что и определяет актуальность проведения исследований с их использованием. Готовые растворы белков хранились не более суток при температуре 4 °С. В качестве представителей люминесцентных зондов ПАУ применялись: флуорен, антрацен и фенантрен («Sigma», США). Исходные растворы ПАУ готовились в этаноле. Рабочие растворы ПАУ в сывороточных альбуминах содержали не более 1 % этанола и анализировались не позднее 30 минут после приготовления. Для исследований применялись флуоресцентные методы, в частности метод тушения собственной флуоресценции белков и метод регистрации флуоресценции люминесцентных зондов ПАУ. Флуоресцентные исследования проводились на флуоресцентном спектрометре LS 55 (фирма «Perkin-Elmer»). Во всех исследованиях учитывался эффекта внутреннего фильтра согласно методике, описанной ранее в нашей работе [5]. Для построения графических зависимостей и обработки данных применяется статистический модуль программы Excel. Экспериментальные данные зависимостей интенсивности флуоресценции от концентрации агентов были аппроксимированны, то есть получены уравнения, описывающие представленные исходные зависимости, и оценена степень приближения. Для этих целей строились линии тренда (линейная функциональная зависимость) и автоматически определялись величины достоверности аппроксимации R2, то есть числа, которые отражают близость значения линии тренда к фактическим данным. Чем ближе к единице величина этого показателя, тем достовернее линия тренда. 22 Экология человека 2019.05 Окружающая среда Результаты Первоначально экспериментально были получены спектры флуоресценции растворов сывороточных альбуминов в фосфатном буфере при pH 7,4 (рис. 1). Использовались растворы с одинаковой концентрацией белков - 1 мг/мл. Спектры регистрировались при длине волны возбуждения флуоресценции белков - 280 нм. 150012501000 - 5002500 -I-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1- 300 350 400 450 500 550 X, нм Рис. 1. Спектры флуоресценции белковых растворов БСА (1) и САЧ (2) Выявлено, что интенсивность флуоресценции сенсорной системы на основе БСА выше, чем на основе САЧ (см. рис. 1), что обусловлено наличием двух флуоресцирующих остатков триптофановой кислоты в макромолекуле БСА, в отличие от макромолекулы САЧ, где имеется только один триптофанил. Наличие в растворах сывороточных альбуминов различных веществ может вызвать тушение собственной флуоресценции белков, на этом основан один из методов исследования структуры белковых молекул и их взаимодействий с различными агентами [3, 10, 12, 13]. Экспериментально обнаружено, что введение в растворы сывороточных альбуминов ПАУ приводит к общему снижению интенсивности флуоресценции белков. На рис. 2 представлена графическая зависимость интенсивности флуоресценции альбуминов (на длине волны максимума спектра флуоресценции 340 нм) от концентрации ПАУ в растворах. Для всех изученных систем зависимость имеет линейный характер. Дополнительным аналитическим сигналом в изученных биосенсорных системах могут служить флуоресцентные характеристики люминесцентных зондов ПАУ, введенных в белковые системы. Экспериментально получены характерные спектры флуоресценции ПАУ (рис. 3), которые регистрируются при длинах волн возбуждения флуоресценции данных ПАУ: для флуорена - 261 нм, антрацена - 353 нм и фенантрена - 292 нм. Установлено, что интенсивность флуоресценции ПАУ возрастает при переходе от водных растворов к растворам сывороточных альбуминов. Это можно объяснить сорбцией молекул ПАУ белками и, как след- Рис. 2. Графики зависимости интенсивности флуоресценции САЧ (а) и БСА (б) от концентрации ПАУ в белковых растворах: 1 - флуорена (■), 2 - антрацена (▲), 3 - фенантрена (•) Рис. 3. Характерные спектры флуоресценции ПАУ в белковых растворах: 1 - флуорена, 2 - фенантрена, 3 - антрацена ствие, уменьшением вероятности безызлучательной потери энергии электронного возбуждения молекул. Выявлено, что интенсивность спектров флуоресценции данных ПАУ в белковых растворах закономерно возрастает при увеличении их содержания в растворах. На рис. 4 показаны линейные зависимости интенсивности максимумов спектров флуоресценции ПАУ (для 23 Окружающая среда Экология человека 2019.05 флуорена 312 нм, антрацена 403 нм и фенантрена 367 нм) от их концентрации в белковых системах. Рис. 4. Графики зависимости интенсивности флуоресценции ПАУ в растворах САЧ (а) и БСА (б) от концентрации ПАУ: 1 - флуорена (■), 2 - антрацена (▲), 3 - фенантрена (•) Обсуждение результатов Исходя из полученных экспериментальных результатов, можно обобщить, что интенсивность флуоресценции и положение максимумов спектров флуоресценции белков чувствительны к наличию различных агентов в биосенсорной системе и могут быть использованы в качестве аналитического сигнала данной белковой сенсорной системы. Тушение собственной флуоресценции белков при введении в биосенсорные системы ПАУ свидетельствует о связывании ПАУ с белковыми макромолекулами и, вероятно, образовании нефлуоресцирующего комплекса белок - ПАУ [6]. При этом антрацен тушит собственную флуоресценцию белков значительнее, чем флуорен и фенантрен, что может быть объяснено тем, что сорбция молекул антрацена на белок осуществляется в непосредственной близости к триптофановым остаткам, что способствует более эффективному образованию нефлуоресцирующего комплекса и более эффективному связыванию антрацена с сывороточными альбуминами. Значительных смещений максимумов в спектрах флуоресценции белков при введении в растворы ПАУ не наблюдалось, что свидетельствует об отсутствии структурных изменений белковых макромолекул под действием ПАУ в изученном диапазоне концентраций - от 10-7 до 10-5 М. Таким образом, можно утверждать, что белковая система чувствительна к наличию данных агентов. Более того, можно говорить о количественном анализе, поскольку зависимость интенсивности флуоресценции белков от содержания ПАУ в данных белковых растворах имеет линейный характер. Однако следует заметить, что селективность определения ПАУ методом тушения собственной флуоресценции белков невысока, что ограничивает широкое использование данного метода в многокомпонентных системах. Повысить селективность метода позволяет регистрация спектров флуоресценции самих ПАУ в белковых системах. Подбирая соответствующие длины волн возбуждения флуоресценции, можно получить характерные спектры флуоресценции ПАУ (см. рис. 3). Увеличение концентрации ПАУ в белковых растворах ведет к возрастанию интенсивности их флуоресценции (см. рис. 4). При этом угловые коэффициенты градуировочных графиков в растворах как САЧ, так и БСА возрастают в ряду: фенантрен, антрацен, флуорен. Данное явление свидетельствует о большей чувствительности определения флуорена предложенным флуоресцентным методом, основанным на регистрации собственной флуоресценции введенного в сенсорную систему люминесцентного зонда. На основании проведенных исследований можно заключить, что люминесцентные методы тушения флуоресценции белков и регистрации флуоресценции люминесцентных зондов ПАУ применимы для изучения взаимодействий ПАУ с белковыми макромолекулами и являются весьма информативными. Выявлено, что при данных концентрациях экотоксикантов (от 10-7 до 10-5 М) зависимости максимумов интенсивности флуоресценции альбуминов и ПАУ от концентрации ПАУ в белковых системах имеют линейный характер, что дает возможность использовать данные системы в аналитических целях для определения экотоксикантов ПАУ в белковых и водных средах. Результаты работы получены в рамках выполнения государственного задания Минобрнауки России на проект № 5.3922.2017/64. Авторство Плотникова О. А. внесла основной вклад в концепцию исследования, получение, анализ и интерпретацию данных, подготовила первый вариант статьи; Мельников А. Г. внес существенный вклад в получение и анализ экспериментальных данных; Мельников Г. В. внес существенный вклад в концепцию исследования, обсуждение результатов, подготовку рукописи для печати; Тихомирова Е. И. внесла существенный вклад в интерпретацию данных, существенно переработала статью на предмет важного интеллектуального содержания; Ильина Н. А. внесла существенный вклад в основную концепцию исследований, окончательно утвердила присланную в редакцию рукопись.

About the authors

O A Plotnikova

Yuri Gagarin Saratov State Technical University

SPIN-code: 1682-8461

A G Mel'nikov

Yuri Gagarin Saratov State Technical University

SPIN-code: 3268-6050

G V Mel'nikov

Yuri Gagarin Saratov State Technical University

SPIN-code: 7267-4911

E I Tikhomirova

Yuri Gagarin Saratov State Technical University

SPIN-code: 7673-8480

N A Ilina

Ulyanovsk State University

SPIN-code: 5535-1246

References

Supplementary files