CHARACTERISTICS OF APOPTOSIS AND NO SYNTHASE IN THE MUCOUS MEMBRANE OF THE HUMAN THE MAXILLARY SINUS IN CASE OF AN INJURY AND CHRONIC INFLAMMATION

Full Text

Травматизм костей лицевого скелета - одна из центральных проблем челюстно-лицевой хирургии, а последствия этих травм занимают лидирующие позиции в структуре причин первичной инвалидности по стоматологии [1]. Современная концепция патогенеза травматического повреждения рассматривает два основных взаимосвязанных механизма гибели клеток: апоптоз и некроз [3, 4, 8, 11, 15]. Апоптоз запускается в момент травмы Едранов Сергей Сергеевич - канд. мед. наук, докторант каф. гистологии, тел. 8 (902) 556-25-64, e-mail:mobilestom@yandex.ru как механизм отсроченного вторичного повреждения ткани и представляет собой физиологическую гибель клеток, необходимую для обновления клеточного пула органов, дифференци-ровки и развития [4, 5]. В то время как некроз - это необратимая гибель клетки, смерть в результате апоптоза на определенных этапах может быть задержана или предупреждена [3]. Поэтому особую актуальность приобретают исследования механизмов активации апоптоза, его временного и пространственного распространения в клеточной популяции. Оксид азота (NO), оказывая регуляторное, фармакологическое и токсическое действие широкого спектра, влияет на 13 РОССИЙСКИЙ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, №3, 2012 процессы физиологической и репаративной регенерации. В зависимости от условий NO может активировать или подавлять апоптоз, избирательно воздействуя на определенные типы клеток [2, 6]. С этих позиций особую актуальность приобретают данные, характеризующие роль апоптоза и NO в посттравматической репарации слизистой оболочки. Целью настоящей работы явилось исследование апоптоза и NO-синтезирующих систем в слизистой оболочке максилляр-ной пазухи человека при травме и хроническом воспалении. Материал и методы Все исследования выполнены согласно правилам этического комитета Владивостокского государственного медицинского университета. Материал слизистой оболочки верхнечелюстных пазух получали в ходе оперативного вмешательства по поводу реконструкции скуловерхнечелюстного комплекса после неправильно консолидированного перелома. Кроме того, исследовали 37 биопсийных образцов от 15 больных с диагнозом гнойно-полипозного хронического риносинусита. Контрольную группу составили лица, не имевшие в анамнезе ЛОР-патологию и челюстно-лицевые травмы. Забор материала в контрольной группе проводили в случае разрыва слизистой оболочки пазухи при выполнении синуслифтинга. Гисто- и иммуноцитохимическое исследование материала начинали не позже чем через 3-6 ч после извлечения. Апоптоз изучали с помощью иммуноцитохимического метода TUNEL (terminal deoxynucleotidil transferase-mediated dUTP nick end-labeling), основанного на выявлении фрагментированных цепочек ДНК. Образцы слизистой оболочки погружали в 4% раствор параформальдегида, приготовленного на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4) и фиксировали в течение 3-4 ч при 4°C. После фиксации материал промывали в течение 1 сут в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4) с 7-8-кратной сменой раствора, а затем погружали в 15% забуференный раствор сахарозы. Срезы толщиной 20 мкм изготавливали в криостате, дополнительно фиксировали в охлажденном растворе этано-луксусной кислоты в течение 5 мин при -20°C, после чего промывали дважды по 5 мин в фосфатном буфере. Для выявления TUNEL-окрашенных структур использовали набор реактивов ApopTag® Direct In Situ Apoptosis Detection Kit (“Chemicon”). После отмывки первичных антител препараты погружали в раствор конъюгированного с пероксидазой антидигоксигени-на, приготовленный в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. В качестве хромогена использовали раствор Vector NovaRed substrate (“Vector Laboratories”). Ядра клеток докрашивали 1% раствором метилового зеленого. Срезы обезвоживали, просветляли в ксилоле и заключали в бальзам. Часть срезов инкубировали в растворе Fap-фрагмента вторичных антител свиньи к Ig кролика, конъюгированных с FITC (“Dako”) в разведении 1:100. Срезы промывали в фосфатном буфере, монтировали на предметные стекла, заключали в глицерин и затем просматривали в фильтре FITC-типа (В1 450490 нм) через микроскоп Polyvar. NO-синтезирующие структуры слизистой оболочки исследовали с помощью гисто- и иммуноцитохимической идентификации NADPH-диафоразы (NADPH-d) и индуцибельной изоформы NO-синтазы (iNOS). Для изучения локализации NA-DPH-d участки слизистой оболочки фиксировали в течение 4 ч в 4% забуференном растворе параформальдегида (pH 7,2) при 4°C. Затем в течение 1 сут образцы ткани промывали в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,2) и 30% растворе сахарозы. Криостат-ные срезы толщиной 20 мкм инкубировали в среде следующего состава: 0,1 мг/мл NADPH, 0,1 мг/мл нитросиний тетразолий, 0,3% тритон Х-100 на 50 мМ трис-ИО-буфере (pH 8,0). Для идентификации iNOS использовали поликлональные кроличьи антитела к iNOS (Cayman, 1:100). Срезы предварительно обрабатывали 1% раствором перекиси водорода для ингибирования эндогенной пероксидазы (5 мин), 3 раза по 5 мин промывали в буфере и для блокирования мест неспеци фического связывания антител в течение 1 ч выдерживали в 1% растворе нормальной сыворотки козы, приготовленном на 0.1 М фосфатном буфере (pH 7,2) с добавлением 0,3% Тритона Х-100. Срезы инкубировали в растворе первичных антител в течение 1 сут при 4°C, затем обрабатывали с авидин-биотин-пероксидазным комплексом с использованием готового набора реактивов Vectastain Elite Kit (“Vector Laboratories”). Отмытые в фосфатном буфере срезы помещали в проявочный раствор хромогена Vector NovaRed substrate (“Vector Laboratories”); степень окрашивания контролировали визуально. Часть срезов инкубировали в растворе Fap-фрагмента вторичных антител свиньи к Ig кролика, конъюгированных с FITC (“Dako”) в разведении 1:100. Срезы промывали в фосфатном буфере, монтировали на предметные стекла и заключали в глицерин. Срезы просматривали в фильтре FITC-типа (В1 450-490 нм) через микроскоп Polyvar. Для количественной оценки результатов исследования в каждом препарате выбирали срез стандартной толщины. Препараты изучали с помощью светового микроскопа, в окуляр которого была вставлена сетка с равновеликими квадратами, позволяющая подсчитать все клетки, прореагировавшие с субстратами инкубационной срезы в данном срезе. Содержание NADPH-d- и iNOS-реактивных клеток определяли как разность между суммой клеток, окрашенных метиловым зеленым. Подсчет TUNEL-позитивных ядер проводили с использованием окуляр-морфометрической сетки на участках слизистой оболочки размером 100 х 100 мкм. Апоптотиче-ский индекс (АИ) определяли как отношение общего числа TUNEL-позитивных ядер (Ntunel) к количеству клеток, окрашенных толуидиновым синим и имеющих видимое непикно-тизированное ядро (Nt), по формуле: АИ = (nTUNEL ^ 10W Данные количественного анализа обрабатывали статистически с определением t-критерия достоверности по Стью-денту (p < 0,05). Результаты и обсуждение В слизистой оболочке верхнечелюстной пазухи у лиц контрольной группы NADPH-d имеет неоднородное распределение. В эпителиальном слое наибольшая активность NADPH-d проявляется в цитоплазме бокаловидных клеток. Высокие призматические эпителиоциты, составляющие основную массу клеточных элементов этого слоя, имеют различную активность, которая варьирует от низкой до умеренной и высокой. В собственной пластинке слизистой оболочки распределены одиночные или собранные в пучки NADPHd-позитивные нервные волокна. В подслизистой оболочке NADPH-d локализуется в цитоплазме фибробластов и тучных клеток, расположенных поодиночке или в виде небольших кластеров из 3-4 клеток. В структурах слизистой оболочки в контроле iNOS не маркируется. При исследовании материала гайморовой пазухи, взятого после реконструкции скуловерхнечелюстного комплекса, нами установлена значительная редукция NADPH-d-позитивных фибробластов и тучных клеток в глубоких слоях слизистой оболочки, однако в эпителиальном слое и подсли-зистой основе подобные изменения выявлены не были (рис. 1, а на вклейке). NO здесь синтезируют в основном клетки поверхностных слоев слизистой оболочки. Связанные с травмой и воспалением изменения экспрессии iNOS наблюдаются в эпителии, тучноклеточной популяции и эндотелии кровеносных сосудов (см. таблицу). В остальных тканевых структурах на всем протяжении патологического процесса iNOS не выявляется. Максимальная активность энзима сосредоточена в верхней порции эпи-телиоцитов и проявляется интенсивным, гомогенным окрашиванием их цитоплазмы (рис. 1, б на вклейке). При травме и хроническом риносинусите со стороны клеток слизистой оболочки верхнечелюстного синуса регистри 14 экспериментально-теоретические исследования Количество i-NOS-иммунореактивных клеток и распространенность апоптоза в слизистой оболочке верхнечелюстной пазухи человека при травме и хроническом риносинусите Структуры слизистой оболочки i-NOS-иммунореактивность Количество TUNEL-позитивных клеток в 1 мм2 контроль травма риносинусит контроль травма риносинусит Эпителий - 26,9 ± 3,1 54,9 ± 3,81 2,3 ± 4,69 17,94 ± 5,5 35,4 ± 2,3 Клетки собственной пластинки - 62,1 ± 2,4 43,9 ± 6,2 4,4 ± 4,2 15,2 ± 4,7 23,48 ± 6,1 Клетки подслизистой основы - 25,3 ± 1,5 23,1 ± 3,4 8,2 ± 2,09 19,83 ± 8,81 30,1 ± 3,6 Тучные клетки - 52,4 ± 1,3 77,2 ± 2,2 6,2 ± 3,8 43,5 ± 3,1 116,6 ± 6,11 руется ярко выраженная апоптотическая реакция (рис. 2 на вклейке). Морфологические “портреты” таких клеток характеризуются конденсацией ядерного хроматина, сморщиванием клетки при сохранной цитоплазматической мембране и разделением на отдельные фрагменты - апоптозные тельца, содержащие фрагменты хроматина и органеллы клетки (см. рис. 2, а на вклейке). Однако специфика повреждающего воздействия влечет за собой появление уникального паттерна распределения апоптотических клеток. Так, при травме апоп-тотические ядра визуализируются во всей толще многорядного эпителия и на протяжении слизистой оболочки имеют тенденцию к очаговым группировкам (см. рис. 2, б на вклейке). Наряду с участками, содержащими активно погибающие клетки, встречаются зоны, где выраженность апоптоза минимальна и находится на контрольных уровнях (см. таблицу). Кроме того, встречаются участки, где в процесс вовлечены исключительно клетки, ядросодержащие сегменты которых расположены в поверхностных слоях эпителиального пласта. В условиях хронического воспаления апоптотические клетки, напротив, доминируют в глубоких уровнях подслизистой основы и, по всей видимости, относятся к фибробластопо-добным и тучным клеткам (см. рис. 2, в на вклейке). В настоящей работе нами установлено, что в условиях травмы и хронического воспаления NADPH-d/iNOS-позитивные эпителиоциты остаются высокоустойчивыми к повреждающим воздействиям в отличие от фибробластов и тучных клеток, количество которых снижается вследствие апоптоза и некроза. Как известно, апоптоз является общебиологическим феноменом, позволяющим регулировать численную популяцию ткани, избавляя ее от устаревших или утративших свое функциональное значение клеточных элементов [9]. Поэтому признаки апоп-тоза, выявляемые иммуноцитохимически с помощью метода TUNEL, могут быть обнаружены в тканях интактной слизистой оболочки - незначительное число эпителиоцитов, а также популяция фибробластов собственной пластинки и подслизистой основы. Мы установили, что снижение количества NADPH-d-позитивных лаброцитов и фибробластов сопровождается нарастанием в них апоптотического индекса. Напротив, NADPH-d-позитивные эпителиоциты остаются резистентными к повреждающим воздействиям в условиях хронического воспаления и практически не подвергаются апоптозу. Морфологическая гетерогенность TUNEL-иммунореак-тивных клеток, вероятно, детерминирована различием механизмов их программированной гибели. В связи с этим предполагается наличие альтернативных путей, запускающих апоптоз при воспалении и травме [13]. Один из них, митохондриальный, индуцируется выработкой транскрипторного фактора p53, дефект которого ведет к опухолеподобной пролиферации эпителиоцитов [12]. Другой механизм апоптоза развивается в лимфоцитах и блокируется фактором Bcl-2 [3]. В митохондриальном апоптозе молекула p53 играет важную роль в изменении стабильности мембраны митохондрий и непосредственно в запуске программированной клеточной смерти [7]. Некоторые авторы ранее высказывались в пользу способности p53 репрессировать ген-промотор Bcl-2 [4] и способности Bcl-2 в свою очередь супрессировать проапоптотическую функцию p53 при хроническом воспалении [14]. Распространенность апоптоза коррелирует с появлением в клетках активности iNOS. Согласно нашим наблюдениям продукция NO свойственна всем тканям слизистой оболочки, однако участие отдельных типов клеток в поддержании баланса NO не одинаково. Превалирующими элементами в данном случае выступают эпителиальные клетки, гладкие миоциты сосудов, тучные клетки и нервные волокна подслизистой основы. Причины индукции фермента в слизистой оболочке могут быть инициированы дегенеративными, метаболическими и ишемическими изменениями, которые неизбежно возникают вследствие воспаления или травмы. В свою очередь последствия индукции энзима связаны с деструктивными и/или про-тективными влияниями NO на ближайшее микроокружение. Очевидно, наиболее дискуссионными остаются причины, ведущие к превращению апоптогенного действия NO в противоположное. Предлагается несколько сценариев развития этих событий. Эндогенное образование NO в ответ на какое-либо изменение внутренней среды приводит к высвобождению ряда других регуляторов, в том числе модуляторных пептидов, для которых NO-зависимый сигнал является индуктором. Так, NO способен регулировать активность про- и противовоспалительных цитокинов через модуляцию активности их рецепторов [10]. При этом восстановление нормального баланса цитокинов происходит более эффективно, чем при воздействии на отдельные цитокиновые системы. Как правило, подобные “цитокиновые” эффекты сопровождаются их влиянием на образование NO и проявляют выраженные трофические и генераторные свойства [16]. NO способен стимулировать развитие апоптоза через непосредственное влияние молекулы на экспрессию p53 и цитокины [6, 15]. Необходимо отметить, что подобные эффекты NO “срабатывают” только при его высоких концентрациях и массивной индукции NOS. С другой стороны, низкая активность энзима и соответствующие низкие показатели выработки NO могут активировать продукцию трофических факторов и, таким образом, предотвращать развитие апоптоза [6]. Результаты настоящей работы позволяют заключить, что развитие апоптоза и степень наработки NO в клетках слизистой оболочки максиллярной пазухи представляет собой взаимозависимый механизм. Активность NO-синтаз является значимым фактором, который определяет апопто-генное и/или антиапоптотическое действие NO при травме или хроническом воспалении. Можно выделить два основных направления развития этого процесса: предотвращение вторичного повреждения клеток путем влияния оксида азота на апоптоз и стимуляция трофики и регенераторных способностей слизистой оболочки. Ингибирование апоптоза может способствовать регенерации, а его стимуляция в перспективе может оказывать цитопротективное влияние при вторичном повреждении продуктами воспалительных реакций

About the authors

S. S Edranov

Email: mobilestom@yandex.ru

References

Supplementary files