THE ROLE OF NITRIC OXIDE IN DAMAGE AND REPARATIONS MUCOUS MEMBRANE MAXILLARY SINUS

Full Text

Оксид азота (NO) - универсальный межклеточный мессенджер - представляет собой исключительно важный регулятор физиологических функций [1, 6, 7]. В последние десятилетия стало известно, что главный механизм регуляции NO связан с увеличением внутриклеточной концентрации циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) и активацией через систему G-киназ кальциевых насосов эндоплазматического ретику-лума [15]. Другим механизмом является активация АДФ-рибозилтрансферазы при участии NO и высвобождение ионов Са2+ из этого второго пула. Наконец, образование NO+, одного из промежуточных продуктов метаболизма NO, влияет на проницаемость кальциевых каналов. Обнаружение описанных свойств позволило причислить NO к таким вторичным мессенджерам, как циклический аденозинмонофосфат, цГМФ, Са2+, инозитолтрифосфат и арахидоновая кислота [6]. Нарушение механизмов регуляции с участием NO отмечают при травме, артериальной гипертензии, ишемии, тромбозах, инфекциях, иммунном ответе, опухолевом росте [5, 42, 53, 56]. Степень продукции NO определяет в конечном счете его эффекторное действие на мишень, которое реали- зуется по двум основным механизмам: цитотоксическому и цитопротективному. В настоящей работе представлен обзор новейших представлений о NO-ергической регуляции, репаративных функций в слизистой оболочке верхнечелюстной (гайморовой) пазухи при травме и воспалении. Идентификация оксида азота в тканях слизистой оболочки верхнечелюстной пазухи Содержание оксида азота в выдыхаемом воздухе впервые установлено в 1991 г. L. Gustafsson и соавт. [30]. Дальнейшие исследования газа в кондукторных отделах легких потенцировали данные об участии NO в генезе бронхиальной астмы и ряда воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей. Данные гистохимических исследований и количественного биохимического анализа позволяют выделить несколько источников, поддерживающих здесь основной пул NO. Валовый синтез NO неизменно регистрируется в эпителии слизистой оболочки носовых путей и особенно околоносовых пазух (ОНП). Редукция выработки NO отмечается при полной обструкции остиомеатального комплекса и риносинуситах [45]. В организме человека наибольшая концентрация NO определяется именно в ОНП [14]. Этот показатель является преци 38 обзоры зионным методом в диагностике функциональных состояний слизистой оболочки ОНП, а также при лечении заболеваний ОНП [59] и риносинуситов различного генеза [22]. Высокая активность NO-синтазы (NOS) выявляется в железистом эпителии ОНП, поступающих сюда нервных волокнах и эндотелии микрососудов [33, 49]. У грызунов, кролика и человека обнаруживается единообразный паттерн окрашивания на NADPH-диафаразу. Ее активность колеблется от умеренной до высокой и очень высокой и определяется по всему эпителию слизистой оболочки [23]. Положительная иммунореактивность к нейрональной NOS локализуется вокруг желез, в стенке мелких артерий и вен, индуцибельный изоэнзим - в покровном и железистом эпителии и клетках воспалительных инфильтратов, а эндотелиальная NOS - в железах собственной пластинки слизистой оболочки и сосудистом эндотелии (рис. 1, а, б на вклейке). В слизистой оболочке верхнечелюстной пазухи человека идентифицирована кальцийнезависимая индуцибельная NOS (iNOS). Энзим находится преимущественно в растворимой форме, менее зависим от кальмодулина и может экспрессироваться в эпителиальных клетках. Иммунореактивность к iNOS наблюдается в шиповатом слое, нейрональная NOS локализуется главным образом в подапикальной части эпителия, а эндотелиальная NOS - только в наиболее апикальной части эпителия (рис. 1, в на вклейке). Таким образом, самой распространенной изоформой в слизистой оболочке ОНП, по всей видимости, является iNOS. За выработку NO отвечает активная мембранносвязанная изоформа энзима; другая изоформа NOS - растворимая - находится в цитоплазме эпителиоцита в неактивном состоянии [36]. Мембранно-связанную форму NOS инактивируют кальмодулинзависимые протеинкиназы, которые стимулируют фосфорилирование каталитических субъединиц фермента. В результате перемещения фосфорилированной неактивной формы NOS из плазматической мембраны в гиалоплазму последняя изолируется от процессов синтеза и экскреции NO, а цитозольный компартмент приобретает резистентность к токсичности NO и не регулируется в сторону понижения активности системными стероидами. Внутривенное введение L-аргинина повышает уровень NO в полости носа до 35% [40]. Удельная концентрация NO в просвете бронхов составляет 7±4 ppb, а в полости носа и носоглотке достигает 900-1000 ppb [34]. При этом уровень атмосферного NO, по данным хемиолюминесценции, не влияет на концентрацию молекул NO в выдыхаемом воздухе [2, 54]. Следует отметить, что экзогенный NO может, однако, диффундировать в эпителий слизистой оболочки полости носа и включаться в метаболический цикл NOS [40]. Следует подчеркнуть, что уровень NO в ОНП всегда значительно выше, чем в полости носа [12, 44]. Средняя концентрация NO в клиновидной (основной) пазухе у человека составляет 2575 ppb, в верхнечелюстной (гайморовой) пазухе - 6792 ppb [34]. Эта разница может быть связана с физической нагрузкой и гемодинамическими факторами [32, 46, 53]. Если при обструктивном синдроме уровень NO обычно значительно выше базального, то интенсивные нагрузки, напротив, снижают его выработку [46, 57]. К факторам, влияющим на содержание NO в полости носа и ОНП, относятся также гипоксия (при давлении кислорода менее 10% от нормы), компоненты табачного дыма, ингибирующие синтез NOS, а также некоторые бактерии [11, 17, 24]. Большинство исследователей признают, что в условиях физиологической нормы NO, помимо своих «стандартных» функций, может осуществлять локальную регуляцию мукоцилиарной активности в верхних дыхательных путях [34, 52]. Так, экзогенное подведение L-аргинина или нитропруссида натрия ведет к усилению колебательных движений ресничек слизистой оболочки, выстилающей полость носа [16]. Это явление коррелирует с изменениями активности NADPH-диафоразы (NADPH-d) в клетках слизистой оболочки верхнечелюстной пазухи и поступающих сюда нервных волокон [50]. Оксид азота как трофический фактор Трофическая активность NO неразрывно связана с его цитопротективным эффектом в условиях гипоксии, травмы или воспаления [61]. A. Wilkins и A. Compston [62] впервые показали, что NO могут секретировать формирующиеся аксоны, прорастающие в окружающую ткань в процессе восстановления после травмы. В серии работ [27, 58] показано, что NO функционирует в этих условиях как нейротрофин, подобно фактору роста нервов, нейротрофину-3 и мозговому нейротрофическому фактору (BDNF). Взаимосвязь функциональных пулов NO и нейротро-финов продемонстрирована при регенерации утраченных клеток эпителия и соединительной ткани кожи и слизистой оболочки кишечника [47]. В этой ситуации NO выполняет функцию стыковочного звена в пространственных взаимодействиях между клетками. Предполагается, что эти эффекты поддерживаются NO-опосредованной вазодилатацией и положительным влиянием газа на процессы метаболической компенсации повреждения. Тесная взаимосвязь сигнальных мессенджеров, а также общность их триггерных механизмов позволяет наряду с локальным воздействием на них использовать модулирующие влияния через системы регуляторов, осуществляющих контроль за экспрессией вторичных клеточных мессенджеров, цитокинов и других сигнальных молекул, а также за запуском генетических программ апоптоза, антиапоптозной защиты, усиления трофического обеспечения [19, 41]. Такие модуляторные влияния устраняют общую дезинтеграцию во взаимодействии сложных и часто разнонаправленных молекулярнобиохимических механизмов, возникающих при травме или воспалении, восстанавливая их нормальный баланс. Очевидно, NO в этих процессах играет ключевую регулирующую роль. Избирательность такого действия объясняется уникальными свойствами молекулы NO. Малая величина, отсутствие заряда, наличие одного электрона с неспаренным спином придают ему высокую реакционную способность и проницаемость. Напротив, короткий (не более 10 мс) период полужизни молекулы существенно ограничивает ареал ее максимальной активности, который едва превышает 7 мкм [6, 7]. Молекулярные свойства оксида азота препятствуют его депонированию во внутриклеточных органеллах, однако идеально подходят для быстрой пространственной сигнализации между соседними клеточными элементами. Специфичность и направленность регуляторного действия NO зависит, с одной стороны, от типа клеток-мишеней, имеющих развитую систему цГМФ-зависимой трансдукции и достаточный уровень растворимой гуанилатциклазы - внутриклеточного рецептора NO, а с другой - от физиологического состояния клеток-эффекторов, экспрессирующих различные изоформы NOS. Несмотря на то что молекулы NO в свободном состоянии существуют всего несколько секунд, длительность их действия может измеряться часами [37]. Образование эндогенного NO в ответ на какое-либо изменение внутренней среды приводит к высвобождению ряда других регуляторов, в том числе и модуляторных пептидов, для которых NO-зависимый сигнал является индуктором. Эффекторная последовательность этих факторов образует так называемый регуляторный континуум, где их совместное действие однонаправленно, а конечный эффект будет суммированным и продолжительным [55]. Так, NO способен регулировать активность про- и противовоспалительных цитокинов через модуляцию активности их рецепторов [29]. При этом восстановление нормального баланса цитокинов происходит более эффективно, чем при воздействии на отдельные цитокиновые системы [55]. Как правило, подобные «цитокиновые» эффекты сопровождаются влиянием на образование NO и проявляют выраженные трофические и генераторные свойства [26]. Мы исследовали показатели активности NOS в слизистой оболочке гайморовой пазухи при экспериментальной деаф- 39 РОССИЙСКИЙ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, №6, 2012 ферентации верхнечелюстного нерва у крыс. В 1-е сутки после рассечения нерва наблюдается резкое сморщивание и уплотнение эпителиального пласта на фоне избыточной активности iNOS. Если в течение 1-х суток изменения, наблюдаемые на стороне, противоположной месту пересечения нерва, не отличались от контроля, то, начиная с 3 сут эксперимента, происходит динамическая перестройка активности фермента в тканях слизистой оболочки как ипси-, так контралатеральной пазухи. Нервные проводники сохраняют небольшую активность NADPH-d, они истончаются, уменьшается число и размеры варикозных утолщений. Уже в 1-е сутки после деафферентации на NADPH-d/iNOS начинают активно реагировать тучные клетки с признаками частичной или полной дегрануляции (рис. 2 на вклейке). Изменения активности iNOS, хотя и не столь явно выраженные, но заметные, происходят также m стороне, противоположной повреждению, и, вероятно, имеют компенсаторный характер. Состояние синтазы оксида азота при травме и хроническом воспалении NO оказывает непосредственное влияние на выраженность воспалительной экссудации в околоносовые пазухи [14]. В настоящее время получены твердые доказательства вовлечения NO в патогенез аллергического и неаллергического ринита, хронического риносинусита и бронхиальной астмы, при которых уровень назального NO резко повышается [9, 20]. В середине 80-х годов ХХ века внимание морфологов привлек тот факт, что активация макрофагов и нейтрофилов сопровождается усиленным синтезом NO. Оказалось, что в этих иммунокомпетентных клетках NO участвует в регуляции NADPH-оксидазной системы и модуляции иммунного ответа. В настоящее время эти данные сложились в целостное представление об NO как факторе, направляющем развитие воспалительного процесса во всех тканевых системах [8]. Кроме того, избыточная продукция газа сама по себе может явиться причиной апоптоза и некроза различных клеток при травме, опухолевом росте, шоковых состояниях [4]. Особенно чувствительны к действию NO эпителиоциты, нервные и мышечные волокна, стволовые и камбиальные клетки. Основная роль в поддержании этих состояний отводится индуцибельной изоформе NOS. Причины индукции фермента в слизистой оболочке могут быть инициированы дегенеративными, метаболическими и ишемическими изменениями, которые неизбежно возникают в результате травмы или воспаления самого разного ге-неза. Появление активности iNOS в тканях полости носа и ОНП отмечается при действии бактериальных эндотоксинов и провоспалительных цитокинов: фактора некроза опухолей, интерферона у и интерлейкина (IL) [28]. Содержание NO в этих условиях коррелирует с функциональным состоянием слизистой оболочки ОНП. Так, вызванная отеком обтурация носовых ходов ведет к нарастанию отрицательного давления внутри ОНП, а возникающая при этом гипоксия индуцирует экспрессию NOS в тканях слизистой оболочки ОНП [12]. Индукция NOS обратима и имеет адаптивный характер. Как правило, с момента индукции и до начала наработки NO проходит несколько часов и именно в течение этого периода происходит транскрипция и экспрессия белковых субъединиц энзима [36]. В свою очередь последствия индукции энзима связаны с деструктивными и/или протективными влияниями NO на ближайшее микроокружение [51]. Данные клинических и биохимических исследований показывают, что описанные механизмы модуляторного действия NO сходным образом функционируют во всех тканях, в которых отмечается развитие посттравматической гибели клеток [25]. Роль NO в этих процессах сводится, главным образом, к цитотоксическому действию молекулы на мишень [48], последовательность «включения» этих факторов, однако, не всегда совпадает с динамикой активности NOS, что позволяет предполагать наличие альтернативных, цитопротек-тивных и противоапоптотических эффектов NO. При исследовании материала гайморовой пазухи, взятого после реконструкции скулы верхнечелюстного комплекса или при хроническом риносинусите, нами установлена значительная редукция NO-синтезирующих фибробластов и тучных клеток в глубоких слоях слизистой оболочки, однако в эпителиальном слое и подслизистой основе подобных изменений не выявлено [3]. Возможно, наиболее важным в этой серии исследований явилось следующее наблюдение: оказалось, что уменьшение количества NADPH-d-позитивных ла-броцитов и фибробластов сопровождалось нарастанием в них апоптотического индекса. Напротив, NADPH-d-позитивные эпителиоциты остаются резистентными к повреждающим воздействиям в условиях хронического воспаления и практически не подвергаются апоптозу [3]. Активная экспрессия iNOS обнаруживается в зонах тканевого воспаления ОНП, где основной пул фермента сосредоточен в цитоплазме нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов и макрофагов [10, 44]. По периферии таких очагов обычно располагаются iNOS-иммунопозитивные фибробласты [8]. Поведение NO в этой ситуации связано с его быстрой реакционной способностью и цитотоксичностью в отношении бактерий, грибов или опухолевых клеток. Влияние NO потенцируется взаимодействием с супероксидными группами (O2-) и образованием пероксинитритов (ONOO-). Последние в свою очередь распадаются на высокореактивные свободные радикалы ОН. и NO2 - окончательные эффекторы токсичности NO, ингибирующие дыхательную цепь митохондрий [7]. Деструктивное действие NO реализуется через участие газа в деаминировании молекул ДНК и потенцирует энергетический дисбаланс клетки. Как установлено, этот процесс унифицирован во всех типах клеток и сводится к активации поли(АДФ-рибоза)-полимеразы, которая катализирует присоединение дополнительных фрагментов АДФ-рибозы к белкам-гистонам и ДНК [8]. Кроме того, NO стимулирует АДФ-зависимое рибозилирование глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, следующую за этим инактивацию фермента и нарушение реакций гликолиза [35]. NO-зависимое повреждение ДНК, активация поли(АДФ-рибоза)-полимеразы и рибозилирование нуклеиновых белков способствуют истощению и гибели патогенных клеток и микроорганизмов также за счет проапоптотического эффекта NO. Включение NO в структуру воспалительных реакций дополняется его иммуномодулирующим действием. Эта активность опосредована экспрессией iNOS в цитоплазме тучных клеток и эозинофильных лейкоцитов при участии гистамина и ряда цитокинов, таких как интерферон у, фактор некроза опухолей a, IL-1, IL-4, ГЬ-ф [5, 60]. Значительная продукция NO противостоит вазоконстрикторному действию медиаторов воспаления, замедляет дальнейшее выделение гистамина из тучных клеток и запускает апоптоз нейтрофилов. Высокие дозы NO, однако, могут привести к прогрессированию эозинофильного воспаления, повреждению эндотелия и альвеолярного эпителия [63]. Кроме того, ряд цитокинов (IL-4, IL-10) и глюкокортикоиды оказывают супрессирующее воздействие на продукцию iNOS и выработку NO макрофагами [8]. Для синтеза NO в цитозоле макрофагов требуется NADPH. Этот же кофермент необходим для образования кислорода с образованием супероксид-цитотоксической макрофагальной системы. Эта последняя конкурирует с NO за овладение одним и тем же коферментом, так как каталаза одновременно ингибирует и синтез NO, и амебоцидную активность макрофагов [26]. Про- и противовоспалительное действие NO можно рассматривать как взаимосвязанные элементы. При патологических состояниях в результате экспрессии индуцибельной изоформы NOS уровень наработки NO резко повышается, достигая критических параметров, при которых его деструктивные эффекты становятся преобладающими. Они реализуются посредством вторичного образования токсических суперок-сиданиона и пероксинитрита. Избыточная выработка NO может также активировать апоптоз воспалительных клеток [21]. 40 обзоры С учетом роли свободных радикалов и NO в развитии апоптоза ведутся активные поиски веществ, способных препятствовать их токсическому воздействию на клетку [31, 39]. NO способен стимулировать развитие апоптоза через непосредственное влияние молекулы на экспрессию р53 и ци-токины [19]. Необходимо отметить, что подобные эффекты NO срабатывают только при его высоких концентрациях и массивной индукции NOS. Вместе с тем низкая активность энзима и соответствующие низкие показатели выработки NO могут активировать индукцию трофических факторов и, таким образом, предотвращать развитие апоптоза [19]. Показано, что при травме и/или хроническом воспалении NO способен усиливать потенциал мембраны митохондрий и изменять химическую структуру цитохрома С. В результате этого происходит повреждение структуры цитохрома и высвобождение его из митохондрий, что в свою очередь активирует каспазу-3 [13]. In vitro установлено разрушающее действие NO на клеточную ДНК [43]. Вместе с тем гистохимические исследования почек in vivo выявили значительное нарастание интенсивности апоптоза в клетках, в которых была наиболее выражена экспрессия NOS [18]. Это свидетельствует о действии iNOS и провоспалительных цитоки-нов, вырабатываемых макрофагами, в качестве триггерного механизма развития апоптоза, что приводит к клеточной альтерации. В то же время имеются данные об антиапоптозном действии NO, согласно которым NO стабилизирует каспазы, препятствуя их активации и блокируя Fas-индуцированный путь развития программированной гибели клеток [38]. Развитие апоптоза и степень наработки NO в клетках слизистой оболочки верхнечелюстной пазухи у человека и крыс представляет собой взаимозависимый механизм. Активность NOS является значимым фактором, который определяет апоптогенное и/или антиапоптотическое действие NO в разные сроки после травматического повреждения. Можно выделить 2 основных направления развития этого процесса: предотвращение вторичного повреждения клеток путем влияния NO на апоптоз и стимуляция трофики и регенераторных способностей слизистой оболочки. Рассмотренные нами данные позволяют суммировать основные модуляторные эффекты NO при повреждении и регенерации клеток слизистой оболочки верхнечелюстной пазухи: • нормализация микроциркуляции за счет вазодилатации, антиагрегантного и антикоагулянтного действия NO; • бактерицидное действие как собственным, так и опосредованным пероксинитритом, образующимся в тканях при взаимодействии NO с супероксид-анионом (NO + O2- = ONOO-); • индукция фагоцитоза бактерий нейтрофилами и макрофагами; • активация антиоксидантной защиты; • улучшение нервной проводимости (нейротрансмиссии); • регуляция специфического и неспецифического иммунитета; • регуляция апоптоза и предотвращение патологического рубцевания.

About the authors

S. S Edranov

Email: mobilestom@yandex.ru

References

Supplementary files