THE INFLUENCE OF CHRONIC RENAL INSUFFICIENCY IN STATUS OF MUCOUS MEMBRANE IN ORAL CAVITY IN EXPERIMENT

Full Text

Хроническая почечная недостаточность (ХПН) представляет серьезную медицинскую, социальную и экономическую проблему. Об этом свидетельствуют как неуклонный рост числа больных с ХПН, так и высокая стоимость лечения и неблагоприятный трудовой прогноз. Поражение различных систем при ХПН является следствием ряда причин, среди которых наиболее часто выделяют уремическую интоксикацию, нарушение водно-электролитного баланса, костно-минерального обмена, развитие сопутствующей сердечной недостаточности, иммунологические нарушения, хотя существуют и другие механизмы, которые в настоящее время остаются недостаточно изученными. В ряде исследований было показано, что длительное течение ХПН приводит к развитию фиброзных изменений в интерстициальной ткани различных органов [1]. Данные литературы о влиянии состояния почек на органы и ткани ротовой полости разнородны и иногда даже противоречивы. Их можно разделить на 3 большие группы: результаты исследований, полностью или почти полностью отрицающие зависимость состояния полости рта от почечной недостаточности [2, 3]; данные, свидетельствующие об отдельных средневыраженных изменениях структур полости рта при ХПН [4-9]; результаты, указывающие на выраженные при сильной коррелятивной связи, реакции со стороны органов и структур ротовой полости на недостаточную функцию почек [10, 11]. Однако в клинических условиях на состояние слизистых оболочек оказывает влияние патологический процесс, происходящий в почках и являющийся основной причиной ХПН. Вместе с этим в научной литературе крайне мало экспериментальных данных о реакциях слизистой оболочки полости рта именно на ХПН: было найдено только 1 сообщение о сочетании ХПН с пародонтозом [11]. Цель исследования - установить основные реакции слизистой оболочки полости рта на ХПН различной выраженности в эксперименте. Материал и методы Эксперименты проводили на самцах крыс инбредной линии Wag массой тела 180-200 г в возрасте 6 мес. Все манипуляции с животными осуществляли под общим ингаляционным эфирным наркозом в условиях чистой операционной с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». В связи с многочисленными моделями ХПН, приведенными в литературе, было решено остановиться на нефрэктомии [12, 13], которая позволяет макси мально устранить индивидуальные реакции каждого животного на введение того или иного вещества. Для морфологического исследования было использовано 48 крыс (табл. 1). Кроме того, для контроля тяжести ХПН и выбора сроков морфологических исследований проводили биохимический контроль плазмы крови в различные сроки после нефрэктомии, для этого было использовано 90 животных (табл. 2). В асептических условиях выполняли послойную срединную лапаротомию. В группе крыс с моделированием ХПН легкой степени удаляли нижнюю половину левой почки, для создания ХПН средней степени полностью удаляли левую почку, при моделировании тяжелой ХПН удаляли левую почку и нижнюю половину правой. Через 6 мес после нефрэктомии содержание мочевины крови у крыс с тяжелой ХПН было выше, чем у интактных крыс и с ХПН легкой и средней степени, в 10,3, 4,2 и 2,1 раза (р < 0,05) соответственно. На этом фоне величина данного показателя у животных с ХПН средней степени была больше в 5 и 2 раза (р < 0,05) соответственно по сравнению с интакт-ным контролем и у животных с ХПН легкой степени. При ХПН легкой степени концентрация мочевины была выше в 2,5 раза (р < 0,05) относительно уровня у интактных животных (табл. 3). Содержание креатинина крови спустя 6 мес после операции у крыс с тяжелой ХПН было выше, чем у интактных и с ХПН легкой и средней степени, в 3,6, 2,4 раза и на 52,3% (р < 0,05) соответственно. На этом фоне величина данного показателя у животных с ХПН средней степени была больше в 2,4 раза и на 59,5% (р < 0,05) соответственно по сравнению с интактным контролем и крысами с ХПН легкой степени. При ХПН легкой степени концентрация креатинина была выше на 49,5% (р < 0,05) относительно интактного уровня (табл. 4). Животных выводили из эксперимента через 6 мес после нефрэктомии передозировкой эфирного наркоза. Фрагменты слизистой оболочки полости рта крыс, биоптированные из области переходной складки нижних резцов, фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 ч, обезвоживали в градиенте этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону и изучали на световом микроскопе Axioimager M1 при ув. 1500. Таблица 1. Группы животных для морфологических исследований Группа животных Показатель интактные с ХПН легкой степени с ХПН средней степени с тяжелой ХПН Всего Количество 12 12 12 12 48 11 РОССИЙСКИЙ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, №3, 2014 Таблица 2. Количество животных в группах для биохимических исследований Группы животных Срок после нефрэктомии, мес Всего 1 2 3 6 9 Интактные 6 6 С ХПН легкой степени 6 6 6 6 6 30 С ХПН средней степени 6 6 6 6 6 30 С тяжелой ХПН 6 6 6 5 1 24 Итого... 90 Таблица 3. Изменения содержания мочевины крови у крыс в различные сроки после нефрэктомии (в ммоль/л, M±m) Группа Срок после нефрэктомии, мес живот ных 1 2 3 6 9 Интактные 4,83±1,6 С ХПН легкой степени 10,2±1,72 10,8±1,47 12,5±1,05 12±1,41 17,8±1,47 С ХПН средней степени 11,2±1,47 18±1,41 22,7±2,34 24±2,97 29,7±2,42 С тяже- 14,8±1,33 25,8±1,47 34,8±2,48 49,8±2,68 58,3 лой ХПН Примечание. Здесь и в табл. 4 в группе с тяжелой ХПН через 9 мес после нефрэктомии ошибка средней величины отсутствовала, так как к этому времени осталось только 1 животное, остальные погибли. Для исследования структурной организации слизистой оболочки ротовой полости измеряли изображения, полученные при помощи цифровой видеокамеры микроскопа, на экране компьютера с использованием программного обеспечения морфологического модуля Axiovision («Zeiss», Германия). Дифференцирование кровеносных и лимфатических сосудов в собственной пластинке слизистой оболочки полости рта крыс проводили в соответствии с рекомендациями J.R. Head и L.L. Seeling [14]. Статистическую обработку результатов выполняли на прикладной статистической программе MS Excel 7.0 («Microsoft», США), определяли среднее арифметическое и ошибку среднего (стандартное отклонение). Достоверность различий сравниваемых средних величин оценивали по критерию Стьюдента. Достоверным считали различие между сравниваемыми рядами с уровнем доверительной вероятности > 95%. При расчетах учитывали, что распределение исследуемых признаков было близким к нормальному. Результаты и обсуждение Через 6 мес после нефрэктомии на фоне ХПН легкой степени отмечены незначительные явления склероза собственной пластинки слизистой оболочки полости рта, при этом увеличилось количество тканевых лейкоцитов и расширились кровеносные и лимфатические сосуды (см. рисунок, а, б). При ХПН средней и тяжелой степени выраженности была обнаружена значительная склеротизация всех отделов слизистой оболочки. Эпителиальная выстилка имела признаки атрофии и гиперкератоза. Сосудов всех типов в слизистой оболочке было мало, но резко увеличено число тканевых лейкоцитов, наблюдалось формирование мелких лейкоцитарных инфильтратов с преобладанием в их цитограмме лимфоцитов (см. рисунок, в-е). При ХПН средней и тяжелой степени количество эпителиальных клеток на единицу длины профиля базальной мембраны было статистически достоверно больше - на 22,3 и 27,1% соответственно, чем у интакт-ных животных (118±8,02 эпителиоцита на 103 мкм длины профиля среза базальной мембраны). Относительная площадь кровеносных сосудов на срезе слизистой оболочки полости рта при ХПН средней и тяжелой степени была меньше, чем при ХПН легкой степени (4,5±0,674% от площади среза), в 2,6 и 3 раза соответственно (см. рисунок, а-е). Площадь лимфатических сосудов при ХПН легкой степени (8,83±1,l1%) была выше на 47,2, 55,7% и в 4,2 раза соответственно относительно интактного контроля и животных с ХПН средней и тяжелой степени. На фоне тяжелой ХПН величина данного показателя была меньше в 2,9 и 2,7 раза соответственно, чем у интактных крыс и при ХПН средней степени (см. рисунок, а-е). Процент интерстициальных пространств при ХПН легкой степени (4,83±0,718) был достоверно большим -на 80,9 и 70,7% соответственно относительно интактного контроля и животных с тяжелой ХПН (см. рисунок, а-е). При ХПН легкой, средней и тяжелой степени численная плотность всех клеток в слизистой оболочке полости рта была больше в 3,7, 4,3 и 4,3 раза соответственно, чем у интактных животных (88,9±10,1 клетки на 105 мкм2 площади среза) (см. рисунок, а-е). Процент лимфоцитов на фоне ХПН легкой, средней и тяжелой степени был статистически достоверно ниже - на 23,3, 34 и 46,9 соответственно относительно интактного контроля (69,8±3,9% от числа всех клеток). Абсолютное количество этих лейкоцитов при ХПН легкой, средней и тяжелой степени, наоборот, было больше в 3, 3,2 и 3 раза также соответственно по сравнению с интактным контролем (69,8±3,9 лимфоцита на 105 мкм2 площади среза). Абсолютное содержание тканевых базофилов при ХПН средней и тяжелой степени было больше в 9,5 и 8,2 раза соответственно по сравнению с интактным контролем (0,663±0,534) клеточного элемента. Количество эритроцитов на единицу площади среза слизистой оболочки лишь на фоне тяжелой ХПН было больше в 12 раз, чем у интактных животных (0,597±0,686 эритроцита). Относительное содержание макрофагов на фоне ХПН средней и тяжелой степени было выше на 84,3% и в 2,4 раза соответственно относительно интактного контроля (2,67±0,778%). Абсолютное количество этих фагоцитов при ХПН легкой, средней и тяжелой степени было больше в 6,5, 7,9 и 10,1 раза соответственно и также по сравнению с интактным контролем (2,38±0,726 клетки). Таблица 4. Изменения содержания креатинина крови у крыс в различные сроки после нефрэктомии (в мкмоль/л, M±m) Група животных Срок после нефрэктомии, мес 1 2 3 6 9 54,5±3,51 70,8±4,83 79,7±5,32 81,3±4,5 81,5±3,73 90,2±7,36 79,3±4,18 89,7±3,33 99,2±6,37 130±4,32 148±5,78 99,8±3,97 120±4,49 149±5,54 198±9,03 253 Интактные С ХПН легкой степени С ХПН средней степени С тяжелой ХПН 12 экспериментально-теоретические исследования Процент плазматических клеток у животных с ХПН средней и тяжелой степени был статистически достоверно выше - в 3,4 и 3,8 раза соответственно относительно интактного контроля (1,33±0,492%). Абсолютное количество плазмоцитов при ХПН легкой, средней и тяжелой степени было больше в 8,3, 14,6 и 16,2 раза соответственно, и также по сравнению с интактным контролем (1,19±0,466 клеточного элемента на единицу площади среза). Относительное содержание клеток с признаками деструкции на фоне ХПН средней и тяжелой степени было статистически достоверно выше - в 6,5 и 7,8 раза соответственно относительно интактного контроля (0,5±0,522%). Абсолютное количество таких клеточных элементов при ХПН легкой, средней и тяжелой степени было больше в 27,3 и 34,3 раза соответственно и также по сравнению с интактным контролем (0,451±0,477 клетки). Следует отметить высокое содержание эозинофилов у отдельных особей со средней и тяжелой ХПН (см. рисунок, в-г). ХПН сопровождается иммуносупрессией [3, 12], в некоторых случаях отмечен сниженный уровень IgA в слюне [9], что приводит к снижению защитных свойств эпителиальной выстилки и собственно слизистой оболочки ротовой полости, которая контактирует с внешней средой и в которую проникает множество микроорганизмов. Кроме того, ХПН приводит к нарушениям водносолевого баланса, задержке воды в организме и отечным изменениям различных тканей. Отек и изменения водно-солевого обмена нарушают питание и оксигена-цию эпителия и таким образом снижают его защитные свойства. Следует отметить, что сама отечная жидкость, имеющаяся в собственной пластинке слизистой оболочки полости рта, является превосходной питательной средой для бактерий. При длительно протекающей ХПН средней и тяжелой степени происходит атрофия эпителия ротовой полости и усиливается слущивание эпителиальных клеток с его поверхности, наблюдается гиперкератоз. О гиперкератозе при ХПН сообщают C.P. Bots и соавт. [15]. Имеется также множество сообщений о гингивальной гиперплазии [8, 10]. Процессы повреждения эпителиальной выстилки компенсируются повышенной митотической активностью клеток базального слоя, где образуются молодые эпители-оциты. Эти клетки имеют небольшие размеры, на единицу длины базальной мембраны их содержится больше, чем у интактных крыс, и, видимо, поэтому возрастает величина данного показателя у всех животных с ХПН. В норме в слизистой оболочке полости рта присутствует небольшое количество различных тканевых лейкоцитов, в основном лимфоцитов, осуществляющих функции местного иммунитета, контролирующих поступление антигена через эпителий и элиминирующих проникшие микроорганизмы. Массивное проникновение бактерий из полости рта через поврежденный эпителий в отечные ткани слизистой оболочки полости рта животных с ХПН способствует миграции туда различных лейкоцитов, что приводит к резкому росту их численной плотности и даже формированию мелких лейкоцитарных инфильтратов. Увеличение содержания плазматических клеток при ХПН средней и тяжелой степени скорее всего свидетельствует о длительности и тяжести воспалительного процесса, а также о возможности вовлечения в него ал лергического компонента [16]. У некоторых животных с ХПН средней и тяжелой степени отмечено существенное увеличение численности эозинофилов, что подтверждает присутствие значительного аллергического компонента в инициации и поддержании воспаления в тканях полости рта. Иными словами, можно говорить о длительно протекающем стоматите и гингивите различной степени тяжести. Эти изменения менее выражены у крыс с легкой степенью ХПН и нарастают по мере прогрессирования недостаточности функции почек. Точно такие же воспалительные изменения слизистых оболочек полости рта отмечают другие исследователи. Имеются данные о развитии при ХПН гингивита [17] и уремического стоматита [4]. Длительно протекающий (хронический) воспалительный процесс, сопровождающийся постоянным повреждением и регенерацией ткани, завершается ее склеротической трансформацией, что было обнаружено в слизистой оболочке полости рта животных со средней и тяжелой степенью ХПН. В пользу этого свидетельствует и атрофия эпителия, о которой сообщают и другие авторы [5, 6]. Активные склеротические процессы подтверждаются повышением численности тканевых базофилов в собственной пластинке слизистой оболочки полости рта у крыс указанных групп. Эти клетки принимают непосредственное участие в формировании соединительной ткани посредством как самостоятельного синтеза некоторых типов коллагена, так и образования ростовых и трансформирующих факторов для фибробластов и других биологически активных веществ [18]. Любая воспалительная реакция, в том числе протекающая в полости рта, сопровождается сосудистыми нарушениями, кровеносные и лимфатические сосуды сначала расширяются, а затем ток крови и лимфы в них останавливается. Этот процесс необходим для предотвращения гематогенной и лимфогенной диссеминации инфекции из воспалительного очага [19]. При легкой степени ХПН было отмечено резкое повышение относительной площади кровеносных и лимфатических сосудов на срезе слизистой оболочки полости рта. Однако при ХПН средней и тяжелой степени относительная плотность сосудов находится на уровне ин-тактного контроля или даже меньше его. По-видимому, это связано со склеротической трансформацией тканей полости рта в группах крыс с выраженной ХПН. Вместе с тем воспаление и сосудистые изменения имеют место даже в этих группах, на что указывает увеличение численности эритроцитов в тканях собственной пластинки слизистой оболочки при тяжелой ХПН. Как свидетельствуют полученные результаты, ХПН даже легкой степени длительностью 6 мес приводит у крыс к значительным изменениям слизистой оболочки полости рта, заключающимся в атрофии эпителия, склеротической трансформации собственной пластинки слизистой оболочки, стоматите и гингивите, которые сопровождаются диффузной и очаговой лейкоцитарной инфильтрацией и сосудистыми изменениями. Можно согласиться с мнением, что состояние полости рта может быть статистически существенным фактором заблаговременного предсказания нарушений почечной фильтрации [7]. Заключение На основании вышеизложенного можно заключить, что у крыс через 6 мес после моделирования ХПН легкой и средней степени собственная пластинка слизистой 13 РОССИЙСКИЙ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, №3, 2014 оболочки полости рта диффузно инфильтрируется лейкоцитами, в ней возрастает объемная плотность компонентов кровеносного и лимфатического русла. При тяжелой ХПН у крыс происходят атрофия и гиперкератоз эпителия слизистой оболочки ротовой полости, собственная пластинка слизистой оболочки склерозируется, в ней значительно увеличивается численная плотность лейкоцитов, в первую очередь нейтрофилов, моноцитов, макрофагов, и формируются мелкие лейкоцитарные инфильтраты. Воспалительные изменения, атрофия эпителия и склеротическая трансформация собственной пластинки слизистой оболочки ротовой полости менее выражены у крыс с легкой степенью ХПН и нарастают по мере прогрессирования недостаточности функции почек. При ХПН средней и тяжелой степени в собственной пластинке слизистой оболочки полости рта возрастает количество эозинофилов и плазматических клеток. Такие особенности лейкоцитарной инфильтрации указывают на возможное присутствие значительного аллергического компонента в инициации и поддержании воспаления в тканях ротовой полости при ХПН.

About the authors

I. V Maiborodin

The Center of New Medical Technologies, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, The Russian Academy of Sciences, Siberian Branch

Email: imai@mail.ru
Novosibirsk, Russia

I. M Minikeev

Scientific center of Reconstructive and recovery surgery Ministries of Health of Kyrgyzstan

Bishkek, Kyrgyzstan

S. A Kim

Kyrgyz state medical institute of retraining and increase qualifications

Bishkek, Kyrgyzstan

T. M Ragimova

The Center of New Medical Technologies, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, The Russian Academy of Sciences, Siberian Branch

Novosibirsk, Russia

References

Supplementary files