Systematic review: the examination of the cytotoxicity of the base materials

Full Text

Введение Базисные материалы протезов при взаимодействии с полостью рта могут вызывать химическое раздражение и аллергические реакции [1, 2]. Самой частой жалобой пациентов является жжение во рту при прямом контакте с протезами верхней челюсти, преимущественно в области слизистой оболочки нёба, а также ротоглотки и языка [1]. Клинически реакция на базисный материал может проявляться отечностью, покраснением и болезненностью слизистой оболочки губ и ротовой полости [3], возможно появление везикулярной сыпи и изъязвлений [2]. Имеется сообщение о случае развития хронической крапивницы в ответ на использование акри- Для корреспонденции: Воронов Игорь Анатольевич, voronov77@ mail.ru ловых полимеров [4]. Аллергия на базисные материалы была подтверждена у сенсибилизированных пациентов с помощью кожных аллергических тестов [5]. В ряде исследований показано отрицательное влияние материалов, используемых в зубном протезировании, на состав микро- и макроэлементов, а также биохимические показатели ротовой жидкости [6, 7]. Из вышесказанного следует, что в стоматологии необходимо уделять повышенное внимание возможным побочным реакциям на протетические материалы. Побочные реакции, вызываемые базисными полимерами при контакте со слизистой оболочкой, связывают с веществами, выделяющимися из материалов [1, 8], особенно с непрореагировавшими остаточными мономерами. Их выделение становится возможным благодаря процессу проникновения воды в материал с последующим расширением пространства между цепями полимеров [9]. Это делает актуальным проведение исследований по оценке цитотоксичности базисных и твердых выстилающих материалов. Цель исследования - систематический обзор литературы, касающейся цитотоксичности материалов протезов, с целью обоснования необходимости дополнительного ограничения выделения веществ с помощью покрытий. Поисковая стратегия была сформирована с учетом ключевых слов, связанных с исследуемым вопросом, к которым относились биосовместимость, цитотоксичность, аллергия, жжение во рту, методики клеточных культур, акриловые полимеры, протезы, мономер, твердые выстилающие материалы. Для ограничения количества исследований и повышения качества обзора были выбраны статьи, написанные на английском языке и опубликованные в рецензируемых журналах, индексируемых в базах данных MEDLINE, Google Scholar и Scopus. Исключали статьи, в которых оценивался одиночный материал. Материал и методы Для включаемых в работу исследований рассматривали метод оценки цитотоксичности, тип базисных материалов и биологическую модель, на которой проводилось исследование. Приемлемыми моделями признавали клеточные культуры животных и человека с отработанным протоколом ведения. В ряде исследований в качестве субстрата использовали эпителиальные клетки, полученные от хомяков [10, 11]. В некоторых исследованиях использовали человеческие эпителиальные клетки [12, 13]. Также часто в качестве субстрата применяли фибробласты, а именно линии L929 [14, 15], BALB/c 3T3 [16] и человеческие фибробласты из десны [12, 17]. В одно исследование включены человеческие моно- бластоидные клетки U-937 [18]. В качестве базисных материалов рассматривали любые акриловые полимеры независимо от типа полимеризации и состава. Различные тестируемые материалы относились к 5 крупным категориям: полимеры горячего отверждения, материалы микроволновой полимеризации, автополимеризуе- мые материалы, светоотверждаемые полимеры и твердые выстилающие материалы. К последней группе были отнесены любые материалы для прямой выстилки основания протеза, независимо от состава и способа полимеризации. Включенные в работу исследования позволили провести сравнение между всеми категориями, за исключением пары микроволновое отверждение - светоотверждение. Среди базисных материалов наиболее часто сравнивали термо- и автополимеризуемые материалы. Несколько исследований предусматривали сравнение других категорий, в 8 исследованиях сравнивали базисные и твердые подкладочные материалы. Во включенных исследованиях изучались действие элюатов из материалов или прямой контакт полимеров с клетками. Цитотоксичность оценивали преимущественно непрямым методом с использованием элюатов из материалов, полученных в разные временные интервалы (от 24 ч до 2 нед). Непрямой контакт между материалом и клетками также обеспечивался через пористую мембрану [16] либо методом агаровой аппликации [19]. В других исследованиях изучался прямой контакт между образцами и клетками [20, 21]. Среди методик, применявшихся для изучения цитотоксичности, можно выделить тесты с использованием 3Н-тимидина [8, 15] и MTT [14, 16]. Тест МТТ основан на количественном определении активности фермента митохондрий сукцинатдегидрогеназы путем оценки превращения водорастворимой соли тетразолия в нерастворимый форма- зан с голубой окраской, обнаруживаемый с помощью спек- трофотометрии [22]. Метод с 3Н-тимидином предусматривает включение радиоизотопа для метки ДНК. Аналогичный метод оценки синтеза РНК состоит во введении в молекулы радиоизотопа 3Н-уридина [10]. К включению радиоизотопов 3^-метионина прибегают для оценки синтеза белков [23], а 14С-ацетата - для оценки липидного синтеза [11]. Наиболее часто в рассмотренных исследованиях использовали тест МТТ, также применяли тесты на основе метаболизма нуклеиновых кислот [15, 24], липидов [11] и белков [23, 25]. Кроме того, оценивали апоптоз [18, 21], подсчитывали количество клеток и колоний [13, 26], применяли метод диффузии в агаре [19] и тест MTS [17]. В большинстве изученных исследований отмечена слишком высокая гетерогенность по статистическим и методологическим параметрам, что делает невозможным сравнение результатов в формате метаанализа, поэтому данные работы были рассмотрены в форме систематического обзора. Термоотверждаемые акриловые полимеры В исследовании A. Hensten-Pettersen и L. Wictorin [26] проводили подсчет приклепленных клеток человеческого эпителия линии NCTC 2544 при росте на образце базисного материала. Включенные в исследование термоотверждаемые материалы были одинаково токсичны. M.R. Cim- pan и соавт. [18] оценивали жизнеспособность клеток при добавлении элюатов из базисных материалов посредством окраски йодидом пропидия и аннексином V, а также количественной оценки ДНК на клетках человеческой ги- стиоцитарной лимфомы U-937. Они обнаружили, что клеточная смертность была значительно выше для всех трех исследованных светоотверждаемых материалов по сравнению с контролем: доля клеток в апоптозе составила при контакте с материалом 5,2%, а в некротическом состоянии - 3,9%. Исследование [21] подтвердило эти результаты, однако не было представлено числовых данных. Другие термоотверждаемые материалы показали одинаковую цитотоксичность при воздействии элюатов на фибробласты линии L929 с оценкой в тесте МТТ [27] и с помощью метода включения 3Н-тимидина [8, 15, 27], однако удлинение времени полимеризации приводило к повышению цитотоксичности [16]. В исследовании на фибробластах BALB/с 3T3 с помощью МТТ-теста при непрямом контакте клеток с материалом для двух светоотверждаемых материалов клеточная жизнеспособность составила 99,8 и 86,2% [16]. В исследовании J.H. Jorge и соавт. [15] светоотверждаемые материалы становились нецитотоксичными в тесте с включением 3Н-тимидина только после предварительной иммерсии в воде. Среди опубликованных исследований только 3 содержали общие данные и параметры (сравнение материалов Lucitone 550 и QC20 с помощью теста с включением 3Н-тимидина) [8, 15, 27], что позволяло провести прямое сравнение результатов. Однако в одном из исследований токсичность преобладала у первого материала, в другом исследовании наблюдалась обратная тенденция, а в третьей работе не было выявлено статистически значимых различий. Автоотверждаемые акриловые полимеры В ходе оценки влияния базисных материалов на скорость роста клеток человеческого эпителия NCTC 2544 при прямом контакте с образцом не было выявлено разницы между 4 типами автоотверждаемых полимеров при одинаково выраженной токсичности [26]. Было также показано, что цитотоксичность данных базисных материалов может значительно варьировать с проявлением от умеренно до ярко выраженного негативного эффекта при оценке по степени апоптоза клеток в культуре и путем подсчета колониеобразующей способности фибробластов L929 [18, 21]. Автоотверждаемые материалы вызывали апоптоз у 5,4-10,1% клеток, а некроз у 4- 9,2% клеток, в то время как в контроле данные значения составили 2,7 и 2,2% соответственно. Таким образом, можно заключить, что автоотверждаемые базисные материалы дают достаточно выраженный цитотоксический эффект. Твердые выстилающие материалы Светоотверждаемые материалы и материалы двойного отверждения показали различную степень цитотоксичности на эпителии щечного мешка хомяков в плане нарушения синтеза белка в клетках при прямом росте на образцах материалов, при этом увеличение времени полимеризации не снижало цитотоксичности [25]. Точно так их в различной степени происходило нарушение синтеза ДНК и РНК в клетках [20]. При изучении же влияния на липидный обмен значительных цитотоксических эффектов выявлено не было, но хотя в данном случае использовали ту же клеточную модель, воздействие на клетки обеспечивалось добавлением в среду элюа- тов из материалов [11], а не прямым контактом, что не позволяет напрямую сравнивать полученные данные. Нанесение на поверхность акриловых пластмасс специального герметика снижало цитотоксичность, но не для всех материалов [23]. В одном из исследований не проводили прямого сравнения материалов, однако результаты позволяют предположить, что элюаты из разных выстилающих материалов могут как стимулировать, так и подавлять синтез РНК в эпителии щечного мешка хомяков [22]. При этом различные твердые выстилающие материалы могут проявлять цитотоксичность как на всем интервале кислого рН, так и только при низких значениях [10]. Из 6 рассмотренных материалов при воздействии их элюатов на фибробласты L929 только 2 могли быть расценены как условно нетоксичные, остальные оказывали сильное влияние на жизнеспособность клеток в МТТ-тесте: доля жизнеспособных клеток в сравнении с контролем колебалась от 58 до 7% [28]. При сравнении различных материалов для выстилки базисов протезов часть элюатов из полимеров показала повышенную цитотоксичность в плане синтеза ДНК в фи- бробластах L929, но при этом более безопасные материалы оказались более токсичными при оценке в тесте МТТ [24]. В ходе анализа синтеза ДНК и белка при росте на образце материала была выявлена относительно пониженная цитотоксичность материалов двойной полимеризации по сравнению со светоотверждаемыми [20, 25], однако это не подтвердилось при оценке в тесте МТТ, анализе метаболизма липидов и синтеза РНК как при прямом контакте, так и при росте в присутствии элюатов [11, 20, 22, 25, 28]. В целом наиболее уязвимым к цитотоксическим эффектам является синтез ДНК, что в клиническом плане вызывает замедление регенерации слизистой оболочки и худшее заживление ее травм [20]. Таким образом, твердые выстилающие материалы продемонстрировали разную степень цитотоксичности от умеренной до выраженной. Сравнение различных материалов В двух исследованиях термоотверждаемые материалы и материалы микроволновой полимеризации показали одинаковую умеренную цитотоксичность на фибробластах десны человека и линии L929 при взаимодействии с элюатами в тестах МТТ, MTS и с включением 3Н-тимидина [17, 27], и только в третьем исследовании цитотоксичность при изучении синтеза ДНК не была обнаружена [15]. При сравнении авто- и термоотверждаемых полимеров в ряде исследований не была обнаружена зависимость степени цитотоксичности от типа материала [13, 19, 26], однако это могло быть связано с тем, что элюаты получали не ранее чем через 2 нед полимеризации. Другие авторы выявили при оценке колониеформирующей способности и степени апоп- тоза, а также в тестах МТТ и MTS значительно более высокую цитотоксичность автоотверждаемых материалов для фибробластов как при прямом контакте с материалом, так и при росте в присутствии элюатов из материалов [14, 17, 21]. В одном исследовании количество жизнеспособных клеток в тесте МТТ после непрямого контакта с двумя термоотверждаемыми материалами составила 98,8 и 86,2%, а автоот- верждаемый материал снижал жизнеспособность клеток до 57,7% [16]. При сравнении термо- и светоотверждаемых полимеров на фибробластах щеки человека и линии BALB/с 3T3, а также линии КВ ротового эпителия человека было установлено, что светополимеризуемые материалы сходны с термоотверждаемыми по цитотоксичности или незначительно менее ци- тотоксичны [12, 16], однако данные всего двух исследований сложно применять к генеральной совокупности. Только в одном исследовании сравнивали микроволновое и химическое (авто) отверждение [17]. После 24 и 96 ч элюции цитотоксичнее был автополимеризуемый материал, однако между 48- и 72-часовыми элюатами разница не была обнаружена, что не позволяет с уверенностью утверждать о преобладании цитотоксичности того или иного материала, однако оба типа активации базисных полимеров значительно уменьшали клеточную выживаемость. В одном исследовании [16] сравнивали свето- и автоотверждение, , при этом химическая полимеризация оказалась значительно более цитотоксичной: выживаемость клеток составила 57,7% против 99,4% для светоотверждаемого материала. Выстилающие материалы оказались более цитоток- сичными в плане синтеза ДНК по сравнению с базисными материалами световой и двойной полимеризации [25]. Это подтвердилось в другом исследовании независимо от клеточной линии и времени элюции [12]. В трех исследованиях не проводили прямого сравнения выстилающих и базисных материалов [10, 22, 23]. Термоотверждаемые базисные материалы также были менее цитотоксичны, чем твердые выстилающие полимеры [10, 20, 22]. Только в одном исследовании наблюдалось исключение: один из выстилающих материалов двойной полимеризации меньше ингибировал синтез белка [25]. Ни в одном из исследований не сравнивали микроволно- во- и светоотверждаемые материалы. Более того, такого сравнения вообще не удалось обнаружить в литературе. В исследованиях использовали различные клеточные линии, при этом первичные культуры клеток должны демонстрировать более надежную и близкую к клиническим условиям информацию, однако для получения первичных культур требуется много времени, причем при получении ткани необходимо начать выделение клеток немедленно, а выход относительно низок, кроме того, время жизни первичных клеток ограничено [12]. Наиболее перспективным методом оценки цитотоксичности является получение из полимеров элюатов, так как данная ситуация приближается к реальной для ротовой полости, однако при этом мы не можем определить роль отдельных выделяемых компонентов. Заключение Данный обзор свидетельствует о том, что все полимеры акрилового происхождения проявляют цитотоксичность в той или иной степени независимо от типа полимеризации, хотя с некоторой долей достоверности можно говорить о меньшей цитотоксичности термоотверждаемых материалов в сравнении с другими по типу активации полимерами. Использование при изготовлении протезов твердых выстилающих материалов приводит лишь к увеличению цитотоксичности. Это дает основание утверждать, что для снижения побочных эффектов протезов из полиметилметакрилата необходим поиск новых способов ограничения поступления вымываемых веществ в ротовую полость. Перспективной в данном случае становится разработка защитных покрытий. Среди таковых особо выделяется разработанное недавно покрытие из карбида кремния, обладающее, помимо барьерных свойств относительно вымывания веществ из акриловых пластмасс, целым рядом дополнительных преимуществ: высокой химической инертностью и устойчивостью к биодеструкции, однородностью, износостойкостью, механической прочностью и хорошей адгезией к ряду материалов при высоких температурах [29].

About the authors

A. L Kalinin

«S.A. Vekshinsky Research Institute of Vacuum Technology»

117105, Moscow

E. A Mitrofanov

«S.A. Vekshinsky Research Institute of Vacuum Technology»

117105, Moscow

Igor Anatolievich Voronov

A.I. Evdokimov Moscow state medico-stomatological universit

Email: voronov77@mail.ru
Department comprehensive dentures 127206, Moskva

A. P Voronov

A.I. Evdokimov Moscow state medico-stomatological universit

Department comprehensive dentures 127206, Moskva

F. T Kadzhaeva

A.I. Evdokimov Moscow state medico-stomatological universit

Department comprehensive dentures 127206, Moskva

References

Supplementary files