Histochemical characteristics of reparative dentinogenesis of the tooth pulp

Full Text

Пульпа зуба - чрезвычайно интересный объект для исследования. Сохранение жизнеспособной пульпы или только корневой ее части при оперативных вмешательствах обеспечивает нормальную трофику тканей зуба и предупреждает развитие периапикальных осложнений. Именно поэтому весьма перспективны биологические методы лечения пульпитов, основанные на использовании защитно-приспособительных сил пульпы [1-3]. Ряд исследователей [4, 5] в научных работах доказали, что после витальной ампутации корневая пульпа сохраняет жизнеспособность, продуцируя вторичный (репаративный) дентин. Другие авторы [6, 7] указывают на возможность образования дентинного мостика на границе между патологически измененными и жизнеспособными тканями пульпы, Для корреспонденции: Сирак Сергей Владимирович, д-р мед. наук, проф., зав. кафедрой стоматологии Ставропольского государственного медицинского университета, E-mail: sergejsirak@yandex.ru когда через 6-8 нед после операции визуально и гистологически обнаруживали дентинные мостики во всех каналах зуба. В нашей стране и за рубежом постоянно ведут поиски наиболее эффективных средств, сохраняющих корневую пульпу и стимулирующих репаративный дентиногенез [8-10]. Для покрытия корневой пульпы некоторые авторы предлагают препараты, содержащие коллаген, мукополисахариды, антибиотики, антисептики, анестетики, гормоны [11, 12]. Особенностью коллагена считают его способность образовывать комплексы с лекарственными и биологически активными веществами, что дает возможность создания лекарственных препаратов пролонгированного действия, в которых коллаген играет роль депо. Перспективно также использование коллагеновой губки в качестве матрицы-носителя для различных тканеинженерных конструкций [13-15]. Очень важная задача - контроль эффективности использования подобных Оригинальная статья средств на клеточном уровне. Особое значение приобретают в этой связи эктомезенхимальные стволовые клетки, дающие начало одонтобластам пульпы зуба. В настоящее время в основе идентификации данных клеток организма лежит оценка их морфологии и поверхностных маркеров. Одним из наиболее перспективных маркеров стволовых клеток остается C-kit (CD117), который служит рецептором к фактору стволовых прогенеторных клеток StemCellsFactor - SCF, что характеризует его как рецептор, маркирующий «взрослые» или «способные к дифференциации» стволовые клетки [16]. В научных публикациях встречаются данные об обнаружении С-kit-позитивных клеток у человека в сердце, желудке и кишечнике, мочеточниках, а также пока только единичные сведения об их идентификации в почках, поджелудочной железе и пульпе зуба [17]. Цель исследования - гистохимическими методами, включая анализ активности C-kit-трансмембранного рецептора белка тирозина, оценить характер репара- тивного дентиногенеза при экспериментальном лечении пульпита с использованием тканеинженерных конструкций с эктомезенхимальными клетками. Материал и методы Исследование проведено на пульпе центральных зубов нижней челюсти 20 взрослых баранов (80 зубов). Для получения экспериментальной модели острого пульпита применяли следующую методику. С язычной поверхности бором формировали полости по типу глубокого кариеса и инфицировали различными штаммами микроорганизмов, выделенных из кариозных зубов человека, после чего зубы пломбировали. Как показали гистологические исследования, такая методика вызывала серозно-гнойное воспаление коронковой пульпы. Через 1 сут под местной анестезией Sol. Ultracaini 4% с адреналином 1:200 000 в асептических условиях производили витальную ампутацию пульпы. Гемостаз пульпы осуществляли стерильными ватными шариками. В основной группе животных (15 животных/60 зубов) на дно пульповой камеры в области устья корневого канала накладывали тканеинженерную конструкцию, состоящую из коллагеновой губки, гидрогеля PuraMatrix/3DM и прекультивированных эктомезенхимальных клеток с последующим пломбированием зуба. В контрольной группе (5 животных/20 зубов) в состав коллагеновых губок вводили гидрокортизон, фурацилин, хондрои- тинсульфат, анестезин, а также кальмецин, поскольку он, как известно, обладает выраженным дентиногенным действием. Зубы удаляли в сроки от 1 дня до 6 мес. Материал, взятый для гистологических исследований (n = 80), фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина, проводили через спирты возрастающей плотности и ксилол, а затем заливали в гистологическую среду «Гистомикс» с использованием гистологического процессора замкнутого типа Tissue-Tek VIP 5 Jr. производства Sakura (Япония). После заливки исследуемые фрагменты пульпы фиксировали на стандартные гистологические кассеты, делали гистосрезы толщиной 3-5 мкм. Для обзорных целей гистосрезы окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван-Гизон и Маллори согласно рекомендациям, изложенным в руководстве Семченко В.В. (2006). С каждого окрашенного препарата, выполняли цифровые снимки (в формате .jpg, размером 3136 х 2352 пикселей в палитре 24 бит) при увеличении 40; 100; 200; 400; 1000. Для покрытия корневой пульпы при биологическом методе лечения пульпита использовали тканеинженерную конструкцию, в состав которой входит гидрогель PuraMatrix/3DM с эктомезенхимальными клетками, иммобилизованными на коллагеновую губку. Данная тканеинженерная конструкция представляет собой синтетический биодеградируемый матрикс-гель на основе олигопептидных фрагментов, формирующий нанонити, и предварительно культивированные эктомезенхимальные клетки барана, обработанные 5-азацитидином. Готовый тканеинженерный продукт получали путем механического смешивания геля с прекультивированными эктомезенхи- мальными клетками in situ, а затем иммобилизовали на стерильную коллагеновую губку, которую получали путем лиофилизации замороженных растворов коллагена. Коллагеновые губки просты и дешевы в изготовлении, легко стерилизуются и могут длительно храниться в обычных условиях. Выбор губки в качестве матрицы-носителя тканеинженерной конструкции обусловлен тем, что, меняя параметры исходного раствора и режима лиофилизации, можно варьировать структуру губки, изменяя тем самым ее механическую прочность, эластичность, адсорбционную емкость, скорость ангио- и неогенеза в зависимости от цели применения. Кроме того, большая внутренняя поверхность, гидрофильность коллагеновых губок обусловливают хороший гемостатический эффект, и губка резорбируется быстрее, благодаря чему осуществляется наибольший контакт корневой пульпы с тканеинженерной конструкцией. Идентификацию введенных в состав тканеинженерной конструкции прекультивированных клеток и собственных клеток пульпы проводили с использованием гистохимических методов оценки, включая анализ активности C-kit-трансмембранного рецептора белка тирозина, который кодируется доминантной аллелью (насыщенным окрасом, white-spotting, или ген W). Полученные материалы исследований анализировали, а статистическую обработку числовых данных проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа и множественного сравнения Ньюмена-Кейлса в программе Primer of Biostatistics 4.03 для Windows. Достоверными считали различия прир < 0,05. Научно-исследовательская работа проведена в рамках Государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации на научные исследования и разработки по теме «Стволовые клетки пульпы зуба в регенерации и иммуномодуляции» совместно с Всероссийским НИИ овцеводства и козоводства и Ставропольским государственным аграрным университетом. Результаты Комбинация коллагена с другими препаратами при витальной ампутации пульпы зуба в эксперименте использована, исходя из принципов патогенетической терапии ран: закрытие раневой поверхности от вторичной инфекции; ускорение дентиногенеза за счет стимуляции его образования на поверхности тканеинженерной конструкции из коллагена с прекультиви- рованными эктомезенхимальными клетками и гидрогелем PuraMatrix/3DM; стимуляции заживления раны и отложения солей кальция путем комплексообразо- вания с хондроитинсульфатом, который служит естественным активатором фибриллогенеза и связывает ионы кальция; ускорение регенерации действием продуктов лизиса. Предполагали, что коллаген в составе тканеинженерной конструкции может стать основой для образования новой ткани и, рассасываясь, постепенно будет замещаться дентином, образуя дентинный мостик, прикрывающий вход в корневые каналы. В сроки 7-14 сут гистологические исследования пульпы зубов в контрольной группе показали явления вакуолизации одонтобластов, гиперемию пульпы, наличие внутрипульпарных кист, кровоизлияний в пульпе и слое одонтобластов (см. рисунок, а на вклейке). На гистологических препаратах в основной группе в эти же сроки после витальной ампутации и наложения коллагеновой губки с тканеинженерной конструкцией также выявлены воспалительные изменения, выражающиеся в незначительном полнокровии сосудов корневой пульпы, отеке, диапедезных кровоизлияниях. К 30-м суткам эксперимента в контрольной группе серозно-фибринознаяэкссудация сменяется диффузной нейтрофильной, а затем лимфоидно-макрофагальной инфильтрацией. Резорбция инокулированной коллагеновой губки в основном осуществляется макрофагами, которые к данному сроку наблюдения местами формируют макрофагальный барьер между губкой и корневой пульпой. В основной группе процессы регенерации пульпы протекают значительно быстрее, и к сроку 1 мес развитие соединительной ткани на месте лизированной коллагеновой губки идет не только с периферии, но и из центра корневой пульпы. Гистохимическими методами установлено, что в резорбции тканеинженерной конструкции активно участвуют многоядерные гигантские клетки, появляющиеся позднее макрофагов вокруг нерезорбированных фрагментов коллагеновой матрицы (см. рисунок, б на вклейке). Через 2 мес после начала опыта в контрольной группе наблюдают фрагменты новообразованного дентина, расположенные на периферии корневого канала, но не смыкающиеся в центре; описанная картина на некоторых препаратах имела вид «прерванного моста». К данному сроку в основной группе во всех исследуемых препаратах отмечают четко сформированный дентинный мостик, по структуре схожий с дентином, отделяющий корневую пульпу от пульповой камеры (см. рисунок, в, г на вклейке). Дентин с хорошо выраженными, параллельно расположенными дентинными канальцами образуется от стенок корневого канала и, смыкаясь, формирует четкий барьер. Корневая пульпа полностью сохранена, иногда отмечается полнокровие сосудов. Слой одонтобластов также хорошо выражен, на некоторых препаратах при четко сформированном дентинном мостике в корневой пульпе отмечают склеротические изменения и очаги Original article лимфогистиоцитарной инфильтрации. Гистохимические методы исследования показали, что в результате использования разработанной тканеинженерной конструкции произошла активизация клеток как эктоме- зенхимального, так и мезенхимального стволовых компартментов пульпы зуба. Именно прекультиви- рованные эктомезенхимальные клетки из тканеинженерной конструкции в короткие сроки обеспечили более активное участие в процессе регенерации пульпы на каждом этапе межклеточного взаимодействия по регуляции большинства биологических процессов, таких как пролиферация, дифференцировка, адгезия клеток и миграция. За счет реакции фосфорилирова- ния тирозина тирозинкиназой обеспечивается связывание трансмембранного рецептора C-kit с лигандом SCF, что позволяет оценить антиапоптотические события в прогениторных клетках на каждом из этапов репаративного дентиногенеза. Таким образом, в контрольной группе при использовании коллагеновой губки в комбинации с различными препаратами, призванными стимулировать регенерацию корневой пульпы после витальной ампутации, образование дентинного мостика протекает значительно медленнее, чем в основной группе. Намечающийся дентинный мостик в контрольной группе мы наблюдали только к сроку 3-5 мес. Напротив, в основной группе репаративный дентиногенез завершался построением дентинного моста к сроку 2-3 мес. Этот процесс был стимулирован и обеспечен клетками тканеинженерной конструкции. В ряде случаев корневая пульпа под дентинным мостиком в контрольной группе вообще не регенерировала, и на большинстве препаратов наблюдали явления ее фиброзного превращения. Заключение Таким образом, в ранние сроки наблюдения от 1 до 7 сут в корневой пульпе после витальной ампутации коронковой пульпы у экспериментальных животных основной и контрольной групп развивается асептическое воспаление. В последующие сроки наблюдения в основной группе разработанная тканеинженерная конструкция оказывает наиболее выраженное влияние на каждом этапе процесса заживления: защищает пульпу от инфицирования, уменьшает экссудацию, оказывает гемостатический эффект, а в отдаленные сроки способствует значительному ускорению образования дентинного мостика. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Sergey Vladimirovich Sirak

Stavropol State Medical University Health Ministry of Russian Federation

Email: sergejsirak@yandex.ru
Dr. med. Sciences, Professor, head. the Department of stomatology of the Stavropol state medical University 355017, Stavropol

E. V Shchetinin

Stavropol State Medical University Health Ministry of Russian Federation

355017, Stavropol

T. L Kobylkina

Stavropol State Medical University Health Ministry of Russian Federation

355017, Stavropol

A. A Adamchik

Kuban State Medical University Health Ministry of Russian Federation

350063, Krasnodar

A. G Sirak

Stavropol State Medical University Health Ministry of Russian Federation

355017, Stavropol

M. Yu Vafiadi

Stavropol State Medical University Health Ministry of Russian Federation

355017, Stavropol

References

Supplementary files