Оценка показателей лейкоцитарной формулы периферической крови животных при внутримышечной имплантации образцов наномодифицированного диоксида титана с поверхностной обработкой пептидом Варнерином

Полный текст

Введение На современном этапе развития стоматологии дентальная имплантация представляет собой один из передовых методов лечения пациентов при различной стоматологической патологии, сопровождающейся частичным или полным отсутствием зубов, в том числе с приобретенными дефектами и деформациями челюстно-лицевой области. Зачастую дентальная имплантация становится незаменимой альтернативой в некоторых клинически сложных случаях. При этом основным конструкционным материалом дентальных имплантатов был и остается титан. Преимущества сплавов титана, в том числе для стоматологических имплантатов, описаны многими зарубежными и отечественными авторами [1-3] и нашли широкое применение во многих сферах медицины для реконструкции и замены жестких тканей человеческого организма. Тенденция роста внедрения дентальной имплантации в повседневную практику врача стоматолога влечет за собой расширение показаний с одновременным увеличением количества осложнений, в основном воспалительного характера [4]. В связи с этим явления переимплантитов становятся основной проблемой после операции дентальной имплантации, особенно в отдаленном периоде [5, 6]. Так, некоторые авторы описывают развитие периимплантита у 28 (56%), а мукозита - у 80% обследованных ими пациентов, имеющих имплантаты [7]. Основополагающим фактором в развитии воспалительных осложнений при дентальной имплантации становится биопленка, неизбежно образующаяся в агрессивной среде организма на материале имплантата в области мягкотканого пародонта. В частности, способностью к организации микробной пленки на конструкционном материале обладают коагулазонегативные стафилококки [8]. Отечественные и зарубежные исследователи предлагают различные возможности ингибирования ее образования. Так, некоторые описывают вариант нанесения на поверхность конструкционных материалов методом магнетронного распыления компонентов, обладающих бактерицидными свойствами: ионов серебра или антибиотиков [9]. Представляется возможным увеличение антибактериальной активности конструкционных материалов путем обработки их поверхности низкомолекулярным катионным пептидом варнерином [10]. Предварительно полученные нами результаты исследования в условиях in vitro свидетельствуют о возможности ингибирования образования биопленки путем нанесения поверхностного наномодифицированного слоя диоксида титана на конструкционный материал [11]. Для усиления пленкоингибирующих свойств мы изучили в эксперименте in vitro совокупное действие наноструктуризации поверхности образцов материала с обработкой пептидом варнерином [12]. В результате возникла необходимость исследования в условиях in vivo. При этом особый интерес представляли белые клетки крови; будучи высокореактивными, они быстро приводят к неспецифическому реагированию в ответ на токсическое или повреждающее воздействие. Цель данной работы - оценка показателей лейкоцитарной формулы крови животных при внутримышечной имплантации экспериментальных образцов наномодифицированного диоксида титана с поверхностной обработкой низкомолекулярным катионным пептидом варнерином. Материал и методы Образцы для исследований (рис. 1 см. на вкл.) представляли собой таблетки, выполненные из диоксида титана (рутила) диаметром 5 мм и высотой 1,5 мм, с нанесенным на их поверхность методом золь-гель технологии наноструктури- рованным слоем в виде наиболее активной низкотемпературной формы диоксида титана - анатаза [13]. Экспериментальные образцы изготавливали на кафедре материалов, технологий и конструирования машин Пермского национального исследовательского политехнического университета. До начала эксперимента образцы для исследований помещали в стеклянные флаконы и стерилизовали автоклави- рованием при температуре 121 oC и давлении 1 атм в течение 60 мин с дальнейшей обработкой низкомолекулярным катионным пептидом варнерином с активностью 30 мг/мл в течение 30 мин. Для экспериментальной части работы лио- филизированный катионный пептид варнерин получали в лаборатории биохимии развития микроорганизмов ) Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН (Пермь). Количество лейкоцитов и показатели лейкоцитарной формулы крови у экспериментальных животных по окончании эксперимента (M±m) Экспериментальная группа Нейтрофилы, % Лимфоциты, % Моноциты, % Эозинофилы, % Лейкоциты, • 109/л Контрольная 1 (стекло), n = 18 24,11±3,85 65,0±2,35 5,44±0,58 5,11±1,49 9,29±0,71 Экспериментальная 2 (TiO2), п = 18 19,62±1,65 71,75±2,16 4,0±0,68 4,25±0,88 15,56±1,73 р 0,322 0,121 0,125 0,638 0,003* Экспериментальная 3 (TiO2 нано), п = 15 16,88±1,73 71,75±2,99 7,0±1,61 4,0±0,88 9,48±0,74 р 0,121 0,158 0,351 0,545 0,857 Экспериментальная 4 (TiO2 нано, варнерин 30), п = 21 14,0±1,81 75,8±2,3 5,6±1,33 2,6±0,62 15,05±1,28 р 0,025*# 0,015* а 0,919 b 0,345 с 0,001* d Примечание. * - р < 0,05 (использован критерий Стьюдента персионный анализ; сравнение 4 групп: # - вариация: межгрупповая дисперсии = 102,9; общая = 11 060; F = s2_меж/s2_вну = 235,2/109 = 2. = 397,1; внутригрупповая = 9172, оценка дисперсии = 95,54; общая = ция: межгрупповая = 777, оценка дисперсии = 155,4; внутригрупповая 155,4/28,9 = 5,377, р = 0. по отношению к контролю); везде использован однофакторный дис- = 1176, оценка дисперсии = 235,2; внутригрупповая = 9881, оценка ,285, р = 0,052; а - вариация: межгрупповая = 1985, оценка дисперсии 11 160; F = s2_меж/s2_вну = 397,1/ 5,54 = 4,156, р = 0,002; d - вариа- = 2775, оценка дисперсии = 28,9; общая = 3552; F = s2_меж/s2_вну = Оригинальная статья В качестве экспериментальных животных использовали белых нелинейных крыс-самцов 4-месячного возраста, с массой тела 180-230 г. , содержащихся в стандартных условиях экспериментально-биологической клиники-вивария, которые были разделены на 4 группы: 1 контрольная и 3 экспериментальных: 1-я группа (контрольная) - внутримышечная имплантация стерильного медицинского стекла (п = 18); 2-я группа (экспериментальная) - внутримышечная имплантация стерильных образцов, выполненных из диоксида титана (п = 18); 3-я группа (экспериментальная) - внутримышечная имплантация стерильных образцов, выполненных из диоксида титана (п =15) с нанесенным поверхностным наноструктурированным слоем; 4-я группа (экспериментальная) - внутримышечная имплантация стерильных образцов, выполненных из диоксида титана (п = 21) с нанесенным поверхностным наноструктурированным слоем, обработанных низкомолекулярным катионным пептидом варнерином. Имплантацию экспериментальных образцов проводили в заднюю внешнюю поверхность бедра животных, очищенную от шерсти и обработанную 70% этиловым спиртом после 3-5 мин ингаляционного наркоза, дополненного местной анестезией ультракаином. В проекции линейного разреза тканей размером 1 см до мышечного слоя экспериментальные образцы вводили стерильным инструментом в мышечную ткань и послойно ушивали рану, с последующей ее обработкой бриллиантовым зеленым (рис. 2 см. на вклейке). Длительность эксперимента составила 28 дней - в соответствии с международным стандартом ИСО/ДИС 10993 «Биологический контроль материалов и изделий медицинского назначения», в котором определена длительность имплан- тационного теста от 7 до 90 сут (Draft International Standard), и с продолжительностью эксперимента ГОСТ Р ИСО 109936-2009 «Оценка биологического действия медицинских изделий», который соответствует ISO 10993-6:2007. Забор крови проводили из полости сердца в пробирку с раствором гепарина (50 ЕД/мл) при выведении животных из эксперимента. Для анализа показателей периферической крови экспериментальных животных (выполнен на автоматическом гематологическом анализаторе Medonic M20, производство Boule Medical A.B., Швеция) мы пользовались международными нормами для крыс [14]. Определяли количество лейкоцитов и лейкоформулу (109 клеток в 1 л). По окончании исследований животных выводили из эксперимента путем перерезки спинного мозга под ингаляционным наркозом с соблюдением правил эвтаназии, руководствуясь положением ISO 10993-2. На проведение исследований получено разрешение этического комитета ПГМУ им. академика Е.А. Вагнера Минздрава России, все эксперименты выполнены в соответствии с «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации», утвержденными приказом Министерства здравоохранения РФ № 708н от 23.08.2010 г и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18.03.1986 (текст изменен в соответствии с положениями Протокола (ETS № 170) после его вступления в силу 2.12.2005; Лиссабонский договор о внесении изменений в Договор о Европейском союзе и Договор об учреждении Европейского сообщества вступили в силу 1.12.2009). Статистический анализ результатов эксперимента проводили посредством программного пакета Biostat и приложения Microsoft Excel полнофункционального офисного пакета Microsoft Office 2007. Характеризуя выборки, определяли выборочные средние величины, ошибку среднего и выборочное стандартное отклонение. Сравнивали выборочные средние между собой при помощи критерия Стьюдента. Для оценки различий между несколькими случайными выборками использовали метод однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным p < 0,05. Результаты и обсуждение Во время проведения эксперимента в течение 28 дней не отмечено случаев гибели животных. Поведение, аппетит, состояние кожных покровов, физиологические функции у животных опытных групп не отличались от таковых у животных группы контроля. Полученные и обработанные результаты экспериментального исследования представлены в таблице. Нейтрофилы, будучи самой многочисленной фракцией лейкоцитов, выполняют основную функцию борьбы с микроорганизмами (инфекционными агентами). Данные исследования свидетельствуют о снижении относительных показателей нейтрофилов во всех экспериментальных группах, но особенно выражено их снижение в 4-й группе (TiO2 нано + варнерин). При изучении количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы венозной крови животных в 3-й группе с наномо- дифицированным покрытием не отмечали увеличения количества лейкоцитов по сравнению с контролем, в отличие от группы без такового покрытия. Изменений в лейкоформуле в 1-й и 3-й экспериментальных группах в сравнении с контрольной группой не отмечено. Как видно из таблицы, на фоне исходной лейкопении отмечается увеличение абсолютного количества лейкоцитов (статистически значимое) в группах: 2 (TiO2), 4 (TiO2 нано, варнерин), с изменением лейкоформулы за счет относительного лимфоцитоза. Исследование в проведенном эксперименте относительных величин моноцитов, которые служат самыми крупными клетками среди лейкоцитов и выполняют свою основную функцию - фагоцитоз, не показали увеличения их количества во всех экспериментальных группах, а в группе 4 (TiO2 нано + варнерин) наблюдали снижение данного показателя почти в два раза в сравнении с группой контроля. При сравнении относительных показателей количества эозинофилов во всех экспериментальных группах с диоксидом титана наблюдали их снижение относительно данных контрольной группы с имплантированным медицинским стеклом, наиболее снижен показатель в группе с предварительной обработкой пептидом варнерином с активностью 30 мг/мл. Данный факт может служить основанием предполагать отсутствие аллергической реакции организма на чужеродный белок (варнерин). Результаты однофакторного дисперсионного анализа ANOVA подтверждают данные Стьюдент-теста, т. е. во всех экспериментальных группах, которым имплантировали материал, отличный от полностью индифферентного стекла, отмечали незначительное нарастание общего количества лейкоцитов венозной крови. Данный факт можно считать общей реакцией организма экспериментальных животных на оперативное вмешательство. В настоящее время этот тезис не противоречит современным данным - фундаментальные исследования в области стоматологии показали, что при имплантации зубных протезов может возникать лейкоцитоз, сопровождающийся повышением СОЭ, что объясняется нормальной реакцией организма на повреждающее действие во время операции имплантации [15]. Представленные данные таблицы для большей наглядности сведены в диаграмму и представлены на рис. 3. Выводы 1. Имплантация экспериментальных образцов диоксида титана с наномодифицированным покрытием не увеличивает количество лейкоцитов в крови экспериментальных животных. 2. Исследуемые образцы диоксида титана при их внутримышечной имплантации экспериментальным животным, в том числе с наномодифицированной поверхностью и обработкой пептидом варнерином, не приводят к изменениям, выходящим за пределы нормальных значений, показателей лейкоформулы. 3. Имплантированные образцы диоксида титана без на- ноструктурированного покрытия вызывают незначительный лейкоцитоз, в то время как имплантация с наномодифициро- ванным покрытием не сопровождается статистически значимым увеличением количества лейкоцитов в венозной крови экспериментальных животных. 4. При имплантации экспериментальных образцов диоксида титана, в том числе с наноструктурированной поверхностью и обработкой антибактериальным пептидом, не наблюдают достоверного увеличения количества эозинофилов, нейтрофилов, моноцитов в сравнении с имплантированным медицинским стеклом. 5. Полученные экспериментальные данные in vivo по изучению показателей лейкоцитарной формулы перифериче- Original article % Рис. 3. Количество лейкоцитов и показатели лейкоцитарной формулы крови у экспериментальных животных, %. ской крови опытных животных с внутримышечно имплантированными образцами наноструктурированного диоксида титана с обработкой пептидом варнерином и ранее опубликованные нами данные экспериментов in vitro по изучению возможности ингибирования образования биопленки на конструкционном материале с нанесенным поверхностным на- номодифицированным слоем из диоксида титана при оформлении соответствующих документов позволяют перейти к клиническим исследованиям. ЯЯ] Нейтрофилы Лимфоциты EH Моноциты Эозинофилы 6. Данные результаты имеют практическое значение для использования их в клинической практике врача-стоматолога в качестве способа профилактики переимплантитов после операции дентальной имплантации путем ингибирования образования бактериальных пленок, на поверхностях конструкционных материалов из диоксида титана посредством наномодифицированния поверхности в виде анатаза с дополнительной поверхностной обработкой антибактериальным пептидом варнерином [16]. Благодарности. Авторы выражают благодарность аспиранту кафедры «Материалы, технологии и конструирование машин» Пермского национального исследовательского политехнического университета Гурову А.А. за помощь в изготовлении экспериментальных образцов диоксида титана. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Оксана Александровна Шулятникова

ФГБОУ ВО Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера Минздрава России; ФГБОУ ВПО «Пермский национальный исследовательский политехнический университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: anasko06@mail.ru

канд. мед. наук, ассистент кафедры ортопедической стоматологии Пермского государственного медицинского университета им. акад. Е.А. Вагнера

614990, г. Пермь

Г. И Рогожников

ФГБОУ ВО Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера Минздрава России

Email: info@eco-vector.com
614990, г. Пермь

С. Е Порозова

ФГБОУ ВПО «Пермский национальный исследовательский политехнический университет»

Email: info@eco-vector.com
614990, г. Пермь

Список литературы

Дополнительные файлы