PHYSICOCHEMICAL CHARACTERIZATION: COMPARATIVE EVALUATION OF ALLOGRAFT BIOMATERIALS AND AUTOGENOUS BONE

Full Text

Введение Кость - это живая ткань, которая служит структурной опорой и участвует в метаболизме кальция. Костная матрица представляет собой сеть белковых (коллагеновых) волокон, пропитанную минеральными солями (85% фосфата кальция, 10% карбоната кальция и 5% фторидов кальция и магния). Минеральная составляющая кости представлена в основном гидроксиапатитом кальция Ca10[PO4]6[OH]2. Костная ткань также содержит незначительное количество неколлагеновых белков, в числе которых - морфогенетические белки кости (BMPs) [1]. Кальций играет важную роль в остеокондуктивной активности костнозамещающего материала и в его ускоренной интеграции за счёт задерживания и концентрации циркулирующих факторов роста (морфогенетических белков кости) и клеток-предшественников кости [2, 3]. Эффект ионов кальция на реакцию костной ткани изучался в нескольких исследованиях in vivo и in vitro - в них, в частности, было показано, что кальцийсодержащее покрытие улучшает остеоинтеграцию титановых имплантатов [4-7]. Костная ткань служит резервуаром и источником кальция для метаболических нужд. Эта функция реализуется за счёт ремоделирования кости. Костная ткань поддерживает кислотно-щелочной баланс в организме также при помощи высвобождения карбонатов и фосфатов. В ходе процесса минерализации сначала откладывается фосфор, а затем к нему прикрепляется кальций [3, 8]. Аутогенная кость обладает остеогенностью (клетки пересаженной кости синтезируют новую кость), остеоиндуктивностью (новая кость формируется за счёт активного привлечения мезенхимальных стволовых клеток из окружающих тканей, которые дифференцируются в строящие кость остеобласты), остеокондуктивностью (трансплантат васкуляри-зуется, и в нем образуется новая кость) и высокой биосовместимостью [3, 8]. Процесс перерождения трансплантата ускоряется из-за наличия в аутогенной кости факторов роста (в основном это морфогенетические белки кости) [9]. Идеальный костнозамещающий материал должен обладать всеми перечисленными характеристиками аутокости. Костнозамещающие материалы можно классифицировать в соответствии с индивидуальным набором этих характеристик [10]. Наилучших результатов при костной трансплантации добиваются при применении аутогенной кости, которая обладает всеми необходимыми физико-химическими и биологическими свойствами и считается золотым стандартом, несмотря на присущие ей недостатки, а именно ограниченную доступность и послеоперационную боль в донорском участке [11, 13, 15, 16, 20-22]. В качестве альтернативы аутокости успешно используются различные биоматериалы: аллогенные (человеческого происхождения), ксеногенные (свиного или бычьего происхождения) и синтетические костнозамещающие материалы на основе кальция (ß-трикальций фосфат ß-ТКФ и гидроксиапатит ГАП) в чистом виде или в комбинации с мембранами (резорбируемые, нерезорбируемые, титановые) и винтами [11, 12, 17, 23-25]. Аллогенные материалы не имеют недостатков аутогенной кости, но используются в клинической практике с меньшим успехом [26-29]. В идеале костнозамещающий материал должен обладать остеокондуктивностью, т. е. служить трехмерным каркасом для прорастания кровеносных сосудов и заселения клетками-предшественниками кости. Он также должен резорбироваться после выполнения своих функций, причём скорость его резорбции должна быть адекватной скорости образования новой кости [30]. Слишком быстрая деградация биоматериала может отрицательно сказаться на процессе регенерации [26], замедленная биодеградация и присутствие нерезорбированных частиц биоматериала после завершения процесса заживления кости может привести не к полной её регенерации, а к образованию «смешанной зажившей ткани» [29]. Цель настоящего исследования заключалась в оценке ряда физических и химических свойств нескольких доступных для приобретения аллогенных биоматериалов, часто использующихся в стоматологической практике в качестве костнозамещающих, а также в сравнении их с аутогенной костью. Материал и методы В исследование были включены 5 аллогенных костнозамещающих материалов (Puros, OsteoSponge, DynaBlast, DIZG Spongiosa и DIZG corticalis) с наименьшим размером частиц из имеющегося ассортимента. Для изучения свойств материалов использовали атомно-абсорбционную спектрометрию (ААС), лазерную дифрактометрию (ЛД) и рентгенодифракционный анализ (РДА). С помощью ААС определяли концентрацию высвобождаемых костнозамещающим материалом ионов кальция; посредством ЛД измеряли размер гранул; РДА применяли для определения фазы, состава и кристалличности материала. Полученные показатели сравнивали с таковыми аутогенной кости. Все образцы были получены непосредственно от производителей в запечатанных флаконах. Перед анализом материал не подвергался обработке. Представленная ниже информация взята из технических данных, указанных производителем. DynaBlast (Keystone Dental, Inc. 144 Middlesex Tumpike Burlington, mA, 01803, USA) - это пастообразный материал, представляющий собой смесь деминерализованной костной матрицы и минерализованной губчатой кости (банки тканей США) на полоксамерном носителе с фазовым переходом обратного типа [31]. Puros (Zimmer Dental Inc. 1900 Aston Ave. Carlsbad, CA 92008, USA) - это аллогенная кость, очищенная в ходе процесса Tutoplast, при котором из материала аккуратно убираются все ненужные составляющие: жировые включения, клетки и антигены, инактивируются патогены, а ценные минеральные компоненты и коллагеновая матрица сохраняются. Материал выпускается в виде кортикальных гранул с размером 0,25-2 мм [28, 32]. OsteoSponge (Bacterin International Inc.600 Cruiser Lane Belgrade, MT 59714 USA) - это аллогенный материал, состоящий на 100% из деминерализованной человеческой губчатой кости без носителя. OsteoSponge производится с применением методов, которые сохраняют нативные факторы роста [27]. Размер гранул варьирует в диапазоне 1-4 мм. DIZG spongiosa и DIZG corticalis (Deutsches Institut für Zell- und Gewebeersatz GmbH, Köpenicker Straße 325. D12555 Berlin) на 100% состоят из человеческой лиофилизированной губчатой кости. Образцы нативной кости получены при удалении 3-х нижних моляров. Кость подвергли гамма-облучению, промыли в спирте, высушили в вакууме при комнатной температуре и измельчили в агатовой ступке [33, 34]. Атомно-абсорбционная спектроскопия (ААС). ААС использовали для определения объёма высвобождения кальция и фосфора из костнозамещающего материала (спектроскоп WFX-210, RayLeigh, BRAIC, Китай). Были подготовлены стандартные рабочие растворы для кальция и фосфора в диапазоне от 0,5 до 10 мкг/л. 0,4 мг каждого биоматериала погружали в 100 мл 0,9% NaCl; кислотность доводили до 7 путём добавления соляной кислоты (0,1 н). Концентрацию кальция подсчитывали в соответствии с законом Бугера- Ламберта-Бера в Д0 (день 0), Д2 (день 2) и далее каждую неделю до 6-й недели [35]. Лазерная дифрактометрия (ЛД). Средний размер частиц с разбросом значений определяли с помощью лазерного анализатора гранулометрического состава частиц (Patrica LA-950 V2 Horiba Instruments, Япония). Расчёт распределения частиц по размерам производили по теории светорассеяния Ми с использованием модели сферы эквивалентного объёма. Крупные частицы рассеивают свет под малыми углами к лазерному пучку, тогда как мелкие - под большими углами. Метод включал использование ультразвукового зонда со временем измерения 20 с при частоте 20 кГц. Диапазон анализа размеров частиц составлял 0,01-3 мкм. Оптическая система анализатора была представлена 2 источниками света: лазерным диодом с длиной волны 650 нм и мощностью около 1,6 мВт и светодиодом с длиной волны 405 нм и мощностью около 0,3 мВт. Размер частиц выражался в виде диаметра сферы эквивалентного объёма [36, 37]. Перед анализом образцы (порошок) были хорошо перемешаны и гомогенизированы. Средний размер частиц с разбросом значений был подсчитан для всех образцов биоматериалов и нативной кости. Рентгенодифракционный анализ (РДА). Для идентификации кристаллических фаз исследуемых образцов использовали рентгеновский порошковый дифрактометр (XRD). Образцы гомогенизированного порошка (2-3 г) запрессовывали в ПВХ-линзы (диаметр 2,5 см, тол щина 2 мм) и анализировали на дифрактоме тре D8 Bruker с медным антикатодом À Ka = 0,154060 нм. Диапазон углов 29 между х° и у° был выбран для получения максимального количества информации о кристаллических фазах. Расшифровка дифрактограмм была выполнена в программном комплексе EVA (Bruker Corporation, Billerica, Massachusetts, USA) с использованием базы данных ICDD. Размер кристаллитов определялся по уширению дифракционных отражений (в ортогональном направлении к плоскости кристалла) и рассчитывался по формуле: Xs = 0,9À/(FWHM-cos9), [38] где Xs - размер кристаллита в нанометрах, À - длина волны рентгеновского пучка в нанометрах (À = 0,15406 нм в нашем случае), а FWHM - полная ширина на половине максимума для угла дифракции при 29 = 25,9° в соответствии с индексом Миллера (002). Результаты Объёмы высвобождения кальция различными материалами в различное время, полученные методом ААС, приведены в табл. 1. Наименьшая концентрация высвобождения кальция отмечалась у OsteoSponge (4,05 мг/г); далее по нарастающей следуют: DynaBlast (6,2 мг/г), DIZG Spongiosa (14,11 мг/г) и DIZG corticalis (23,63 мг/г). У Puros (24,94 мг/г) этот показатель был сопоставим с таковым нативной кости (20,15 мг/г). Средний размер частиц D50 (в объёмных процентах), диапазон размеров частиц (D и D ), соответствующий границе распределения, ниже которой находятся 10 и 90% частиц соответственно, а также диапазоны размеров частиц, указанные производителями биоматериалов, представлены в табл. 2. Среди биоматериалов наименьший средний размер частиц отмечался у DIZG spongiosa (394,24 мкм); далее по нарастающей следуют: DIZG corticalis (451,55 мкм), Puros (630,47 мкм), DynaBlast (777,14 мкм) и OsteoSponge с самым высоким показателем (902,41 мкм). Ни у одного материала средний размер частиц не был близок к таковому аутогенной кости (282,1 мкм). Самый узкий диапазон размеров частиц наблюдался у DIZG spongiosa (133,10-777,14 мкм), за которым следуют DIZG corticalis (152,45-890,11 мкм), Puros (174,62- 1167,72 мкм), DynaBlast (39,24-1754,62 мкм) и OsteoSponge (174,62-2301,84 мкм) с наибольшим разбросом. Результаты рентгенодифракционного анализа, позволяющие судить о химическом составе материалов, суммированы в табл. 3. Различающиеся показатели дифракции рентгеновских лучей указывают на различные степени кристалличности, о чём свидетельствуют значения ширины пиков. Общей кристаллической фазой для материалов служил гидроксид-силикат-фосфат кальция (Ca5(PO4)285(SiO4)015(OH). OsteoSponge оказался единственным образцом с триклинной сингонией. DIZG spongiosa и DIZG corticalis имели моноклинную сингонию и химический состав в виде CaP2O6. Образцы остальных материалов были кристаллизованы в гексагональной системе и имели различную степень кристалличности. Обсуждение Чем выше концентрация высвобождаемого кальция, тем большей деградации подвержен материал [3, 33, 34]. Кислотный буферный раствор до некоторой степени имитирует кислотную среду во время остеокластической активности или резорбции кости [3, 33, 34]. Биоразложение в условиях in vivo происходит путём растворения или клеточноопосредованных реакции с участием многоядерных клеток, остеокластов и макрофагов [3, 33, 34, 37, 39]. В нашем исследовании различные аллогенные биоматериалы высвобождали кальциИ в различных объемах. Это объясняется тем, что скорость деградации биоматериала in vivo и in vitro зависит от его состава, размера частиц, степени кристалличности, пористости и метода технологическои обработки [3, 33, 34, 37, 39]. Что касается размеров частиц, то полученные данные свидетельствуют о расхождении измеренных диапазонов размеров и диапазонов, указанных производителями. Производители не оговаривают используемую технику определения характеристик кристаллического материала, что может объяснять наблюдаемые различия [40-44]. Следует, однако, иметь в виду, что анализируемые гранулы отличались не только размерами, но и физико-химическими своиствами. Сложно судить о влиянии своИств и характеристик КМ на биологическую реакцию, учитывая, что в опубликованных исследованиях используются различные типы КМ с разными диапазонами размеров частиц. В настоящем исследовании взаимосвязь между размером частиц и объёмом высвобождения кальция в различные периоды времени не выявлена. Рентгенодифрактограммы различных материалов и на-тивноИ человеческоИ кости были весьма схожи с дифракто-граммоИ кристалла гидроксида-силиката-фосфата кальция (Ca5(PO4)285(SiO4)015(OH). Силикаты (при наличии) не являются основными компонентами кристаллических фаз в силу ничтожности их стехиометрического содержания (0,15) по сравнению с фосфатами (2,85). Следует подчеркнуть, что в костноИ ткани и во всех КМ соотношение Ca-P колеблется в диапазоне от 1,75 до 1,33. Это может означать, что кальциИ - основной элемент, компенсирующий фосфатные заряды. Рентгенодифрактометрия показала, что кристаллы естественной кости анизотропны и имеют размеры: 9,42Á в направлениях a и b и в направлении с, при этом альфа и бета составляют 90°, гамма - 120°. Размеры анизотропных кристаллов OsteoSponge: 6,25Á в направлении а, 11,9Á в направлении b, 5,6Á в направлении с. Размеры анизотропных кристаллов DynaBlast: 25,84Ä в направлении a, 5,12Ä в направлении b и 13,78Ä в направлении c. DIZG spongiosa и DIZG corticalis имели одинаковые размеры анизотропных кристаллов: 16,99Ä в направлении a, 7,71Ä в направлении b и 6,99Ä в направлении с. Результаты указывают на сходство форм кристаллов DIZG spongiosa, DIZG corticalis и аутогенной кости (моноклинная). Кристаллы OsteoSponge имели триклинную форму, а кристаллы Puros - гексагональную. Триклинная структура относится к низшей категории кристаллической системы по набору элементов симметрии. В данном исследовании изучались физико-химические характеристики 5 различных аллогенных материалов в сравнении с аутогенной костью. Были обнаружены значительные различия в объёме высвобождения кальция, размерах частиц и степени кристалличности даже у материалов со схожими химическими характеристиками. Хотя эти морфологические различия в значительной степени влияют на поведение биоматериалов in vivo, они часто не учитываются при оценке биологических свойств. Изучение биоматериалов необходимо для понимания их поведения в клинических условиях. Поскольку выбор костного материала во многом зависит от клинической ситуации и связанных с ней биологических и механических требований, важно понимать, что разные костные материалы не могут иметь одинаковую эффективность и что подтверждение эффективности использования в одной клинической ситуации не означает, что материал будет работать идентично в другой анатомической ситуации. Следует надеяться, что в будущем гибридные или комплексные комбинированные костные материалы, включающие в себя клетки, факторы роста и/ или элементы генной терапии, станут более эффективными инструментами для устранения костных дефектов в хирургической стоматологии при реабилитации пациентов со значительной атрофией костной ткани челюстей. Совершенно очевидно, что в этом направлении продолжаются научные исследования. Результаты Наибольшая концентрация высвобождаемого кальция (24,94 мг/г) наблюдалась у Puros, наименьшая - у Osteo-Sponge (4,05 мг/г) - в сравнении с 20,15 мг/г у естественной кости. Средний размер частиц (D) варьировал в диапазоне от 394,24 мкм (DIZG Spongiosa) до 902,41 мкм (OsteoSponge) в сравнении с 282,1 мкм у естественной кости. Кристаллы кости и Puros имели гексагональную форму, кристаллы Os-teoSponge - триклинную, кристаллы остальных материалов - моноклинную. Заключение Выбор биоматериала во многом зависит от клинической ситуации и определяет требования к его биологическим и механическим свойствам. Морфологические различия между материалами существенно влияют на их поведение в условиях in vivo. В ходе исследования были выявлены значимые различия между материалами по таким показателям, как концентрация высвобождаемого кальция, размер частиц и кристалличность.

About the authors

Antoine Berberi

Malkan Abdrashidova Amkhadova

Email: amkhadova@mail.ru
Dr. med. Sci., head the Department of surgical dentistry and implantology of the Vladimirskiy MONIKI.

Antoine Samarani

Georges Aoun

References

Supplementary files