NEW OPPORTUNITIES LOCAL MEDICAL TREATMENT OF PERIODONTAL DISEASES (MICROBIOLOGICAL RATIONALE)

Full Text

Заболевания пародонта - гингивит, пародонтит, пе-риимплантит - по-прежнему встречаются в ежедневной практике врача-стоматолога. Основной причиной воспаления тканей десны разной степени считается патогенное воздействие пародонтопатогенной микрофлоры рта. Среди них: Streptococcus constellatus; Staphylococcus aureus; Fusobacterium nucleatum; Ag-gregatibacter actinomycetemcomitans [1-10]. Лечебные мероприятия, базирующиеся на элиминации микрофлоры путём профессиональной гигиены рта, включают противомикробные медикаментозные средства. До настоящего времени актуален поиск эффективных антисептических средств для лечения заболеваний пародонта. В компании «Солагифт» (г. Томск) разработаны субстанции из хвойной зелени деревьев для наружного применения, среди которых привлекает внимание с позиций возможного использования для лечения заболеваний пародонта концентрат полипренолов (75-85 %). Он представляет собой маслянистую жидкость без посторонних включений, цвет от светло-жёлтого до красновато-оранжевого, имеет специфический вкус и запах. По данным компании, препарат полипренолов проявляет противовоспалительную и противовирусную активность; оказывает ранозаживляющее действие, значительно ускоряя регенерацию повреждённых тканей; обладает антиоксидантными и капилляроукрепляющими свойствами; стимулируют обменные процессы в коже. Препарат является биологически-активным компонентом косметических и фармацевтических кремов и мазей, ускоряющих заживление ран и ожогов, повышающих эффективность комплексного лечения хронических заболеваний кожи. Цель исследования - микробиологическое изучение чувствительности пародонтопатогенов к препарату хвойных полипренолов. Материал и методы Совместно с Научно-исследовательским медикостоматологическим институтом (НИМСИ) МГМСУ им. А.И. Евдокимова проведены микробиологические исследования целесообразности применения хвойных полипренолов в пародонтологии. Для микробиологического изучения чувствительности пародонтопатоге-нов к хвойным препаратам использовали следующие клинические изоляты микроорганизмов: Streptococcus constellatus; Staphylococcus aureus; Fusobacterium nucleatum; Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Выделение и культивирование полученных штаммов проводили в соответствии со стандартным протоколом [2]. В данной статье представлено изучение препарата хвойных полипренолов в разведении 1 : 5. Критерии сравнения: изменение фазы адаптации (лаг-фаза), изменение фазы геометрического роста, амплитуда пика фазы геометрического роста, длительность стационарной фазы, срок отмирания культуры. Основой для проведения исследования являлась автоматическая система культивирования микроорганизмов в режиме реального времени - биореактор «Реверс-Спиннер RTS-1» (BioSan, Латвия). Данная система предназначена для многоканального культивирования микроорганизмов и оценки их роста в режиме реального времени. Интерпретацию результатов проводили по изменению оптической плотности (OD) при длине волны 1=850 нм с использованием встроенного в биореактор дисплея. Оптическая плотность измерялась в единицах Mcf. В графиках динамики оптической плотности обозначения С- и С+ обозначали линии «контроль среды» и «контроль культуры» соответственно. Для культивирования микроорганизмов в биореакторе использовались жидкую питательную среду производства Himedia Laboratories Pvt. Limited (Индия). Для культивирования микроорганизмов в биореакторе использовали тип пробирок TubeSpin®, SW объемом 50 мл с мембранным фильтром для регулирования газообмена (для аэробного и анаэробного культивирования). Для каждого эксперимента отдельно в стерильных пробирках объемом 8 мл готовили бактериальную взвесь в общем количестве 5 мл. Оптическую плотность полученной взвеси измеряли с помощью денситометра DEN-1B (BioSan, Латвия), которая в конечном итоге для каждого эксперимента составила 0,5±0,3 Mcf. Эксперимент продолжался не менее 3 сут, максимум 7 сут. Результаты и обсуждение По результатам культивирования клинического изолята A. Actinomycetemcomitans с концентратом по-липренолов в контрольной пробирке лаг-фаза длилась до 27 ч (см. рисунок на вклейке). Ускорение бактериального прироста продолжалось в течение 8 ч, что ознаменовало начало логарифмической фазы роста (ускоренный рост на промежутке 27-36 ч). Экспоненциальная фаза роста, характеризуемая максимальной скоростью деления бактерий, в контрольном образце отмечалась на промежутке с 36-го часа (0,54 Mcf) до 48-го часа (6,00 Mcf). В данной фазе рост клеток происходит с постоянной удельной скоростью, т.е. единица микробной биомассы в единицу времени увеличивается на одну и ту же величину. Однако в первой половине этой фазы деление клеток опережает их рост, клетки мельчают, но во второй половине скорости роста и деления клеток уравновешиваются. На протяжении всей экспоненциальной фазы клетки продолжают сохранять высокую физиологическую активность, свойственную молодым популяциям. Изменение оптической плотности на данном временном промежутке составило более 5,00 Mcf. Фаза торможения или замедленного роста, характеризуемая в период линейного роста постоянной скоростью прироста биомассы (числа клеток), была достаточно продолжительной - с 48-78 ч культивирования, с выходом в стационарную фазу культивирования с показателем 7,23 Mcf (78 ч). Соотношение отмирающих, вновь образующихся и покоящихся клеток становится стабильным. Прироста биомассы не наблюдается. Средний показатель стационарной фазы составил 7,20 ± 0,05 Mcf. Значительное удлинение фазы адаптации отмечалось в образце с разведением концентрата 1:5. Ускорение бактериального прироста началось только с 48-го часа культивирования, что почти на 18 ч позже, чем в контрольном образце. Фаза ускоренного роста также была длиннее, чем в других образцах, и выход культуры в экспоненциальный рост был отмечен только к 73-му часу культивирования. Продолжительность лог-фазы 25 ч, максимальный показатель - 5,12 Mcf. Средний показатель в стационарной фазе - 5,25 ± 0,05 Mcf, что на 27 % меньше, чем в контрольном образце. По результатам культивирования клинического изолята F. Nucleatum с хвойными полипренолами в контрольной пробирке, фаза адаптации продолжалась около 36 ч, первые признаки начала бактериального прироста отмечалось после 37-го часа культивирования с менее выраженной фазой ускоренного роста (39-45 ч). Средний показатель изменения оптической плотности составил 0,22 Mcf (снятие показаний OD каждые 3 ч). Экспоненциальная фаза роста, характеризуемая максимальной скоростью деления бактерий, в контрольном образце отмечалась с 45-го часа (0,45 Mcf) до 73-го часа (4,98 Mcf). В данной фазе отмечается высокая скорость бактериального прироста и изменение оптической плотности в среднем на 5,5 ± 0,05 Mcf. Фаза замедленного роста объединяет две фазы - фазу линейного роста (р = const) и фазу отрицательного ускорения (98-103 ч). Фаза характеризуется в период линейного роста постоянной скоростью прироста биомассы (числа клеток). Затем при переходе в фазу отрицательного ускорения численность делящихся клеток уменьшается. Стационарная фаза характеризуется равновесием между погибающими и вновь образующимися клетками. Факторы, лимитирующие рост бактерий в предыдущей фазе, являются причиной возникновения стационарной фазы. Прироста биомассы нет. Средний показатель стационарной фазы составил 5,4 ± 0,05 Mcf. В разведении концентрата в соотношении 1 : 5 отмечалось небольшое увеличение адаптивной фазы с моментальным переходом культуры в фазу логарифмического роста. В данных образцах скорость генерации существенно снижена в сравнении с «классической» лог-фазой, поэтому в данном случае происходит пропорциональное увеличение численности бактериальных клеток - «сбалансированный рост». Необычно быстрое увеличение количества клеток сразу после фазы адаптации, вслед за чем скорость накопления клеток понижается, связано с частичной или полной синхронизацией деления клеток в культуре. Синхронизация культуры наступает в том случае, когда все клетки начинают делиться с почти одинаковой скоростью, при этом зависимость логарифма количества клеток от длительности культивирования приобретает ступенчатый характер в отличии от линейного при обычном асинхронном росте в периодическом режиме культивирования (концентрация исследуемого образца в соотношении 1 : 5). Средний показатель стационарной фазы в концентрациях 1 : 10 и 1 : 5 - 3,44 ± 0,05 Mcf, что на 38 % меньше, чем в контрольном образце. В контрольной пробе наблюдали типичный рост бактериальной популяции S. aureus в эксперименте с хвойными полипренолами. Начальная, или фаза адаптации, составляла 3 ч, после чего ускоренный рост переходил в экспоненциальную фазу, и кривая стремительно достигала максимума на 10-й час (2,53 Mcf). Стационарная фаза была непродолжительной и длилась 5 ч, после чего культура перешла в фазу отмирания. Продолжительность стационарной фазы зависит от состава питательной среды, возраста изначальной культуры, а также от таких процессов, как использование запасных веществ, распад части рибосом и синтез ферментов. По-разному наблюдаемая картина зависит от того, какой именно фактор лимитирует рост бактериальной популяции. Быстрой гибели подвержены лишь очень чувствительные клетки, другие ещё долго сохраняют жизнеспособность, до тех пор, пока есть возможность получать необходимую для этого энергию в процессе окисления каких-либо запасных веществ или клеточных белков. «Урожай» стационарной фазы отмечен средним показателем 2,43 ± 0,05 Mcf. Фаза отмирания характеризовалась стадией ускоренной гибели, без перехода в стадию лог-отмирания, так как прослеживалась картина, характеризующаяся превышением количества отмирающих клеток над количеством вновь образующихся, и скорость постоянного отмирания клеток не наблюдалась. При концентрации 1 : 5 прослеживается явное бактериостатическое воздействие исследуемого образца, поскольку роста не наблюдалось вовсе. Оценка чувствительности к различным концентрациям исследуемого хвойного полипренола микроаэрофильного S. constellatus показала следующее: фаза адаптации, охватывающая промежуток от момента посева бактерий до видимого начала их роста в контрольной пробирке, продолжалась в среднем до 4 ч культивирования, у сравниваемых образцов отмечено удлинение данной фазы в среднем на 2-4 ч. Экспоненциальная фаза, характеризующаяся прогрессирующим нарастанием скорости деления клеток, имела достоверные отличия при разведении исследуемого образца в соотношении 1 : 5. В данном образце отмечались и спад скорости генерации популяций, и ярко выраженная фаза замедления. Средний показатель на пике стационарной фазы при разведении 1 : 5 - 1,03 Mcf, что статистически недостоверно в сравнении с контрольным образцом. Заключение Таким образом, в сравнении с параметрами культуры изученных пародонтопатогенов в контроле присутствие хвойных полипренолов приводило к значительному снижению активности всех микробов по всем критериям, особенно Staphylococcus aureus, рост которого полностью подавлялся.

About the authors

A. N Kalinina

“Clinical centre of dentistry FMBA of Russia”; “Institute of advanced training of FMBA of Russia”

123098, Moscow; 125371, Moscow, Russia

I. S Lasko

“Clinical centre of dentistry FMBA of Russia”; “Institute of advanced training of FMBA of Russia”

123098, Moscow; 125371, Moscow, Russia

V. N Tsarev

“Clinical centre of dentistry FMBA of Russia”; “Institute of advanced training of FMBA of Russia”

123098, Moscow; 125371, Moscow, Russia

Egor Evgen'evich Olesov

“Clinical centre of dentistry FMBA of Russia”; “Institute of advanced training of FMBA of Russia”

Email: kc@stomfmba.ru
Dr. Med. Sci., Profossor 123098, Moscow; 125371, Moscow, Russia

A. F Stepanov

“Clinical centre of dentistry FMBA of Russia”; “Institute of advanced training of FMBA of Russia”

123098, Moscow; 125371, Moscow, Russia

E. V Glazkova

“Clinical centre of dentistry FMBA of Russia”; “Institute of advanced training of FMBA of Russia”

123098, Moscow; 125371, Moscow, Russia

V. N Olesova

“Clinical centre of dentistry FMBA of Russia”; “Institute of advanced training of FMBA of Russia”

123098, Moscow; 125371, Moscow, Russia

References

Supplementary files