MICROTEST FOR THE DETERMINATION OF THE AMYLOLYTIC ACTIVITY OF SALIVA ALPHA-AMYLASE



Cite item

Full Text

Abstract

It is known that the concentration of alpha-amylase in saliva can determine its catalytic activity, the decrease of which occurs during various pathological processes in the oral cavity. The overwhelming number of methods for determining the catalytic activity of enzymes involve the use of a large volume of reagents and samples, which makes it difficult to study saliva in large groups. The purpose of the study is to evaluate the possibility of using the microvariation of the reaction to determine the activity of saliva alpha-amylase, as well as to analyze the dependence of the enzyme activity on its concentration. Materials and methods. Saliva was obtained from 15 people with intact periodontal disease and the dentition, without somatic pathology. For in vitro studies, alpha-amylase solutions were prepared with an enzyme concentration of 10; five; 2.5; one; 0.5 and 0.25 mg / ml ex tempore. To save samples and reagents, the volume of the reaction participants was proportionally reduced. The further analysis procedure was carried out according to the instructions of the manufacturer of the «AMYLASE-VITAL» reagent kit to determine the activity of alpha-amylase. Statistical analysis of the results was performed using the Student’s t-test in the program Statistica 7.0. Results. The comparability of the results of determining the activity of alpha-amylase using the classical and microplate variants of the reaction is shown. With an increase in alpha-amylase concentration from 0 to 2.5 mg / ml, a directly proportional increase in enzyme activity is observed. In the case of an increase in the concentration of alpha-amylase above 2.5 mg / ml, a decrease in its activity is shown, which may be due to the precipitation of a part of the enzyme. The activity of the enzyme in saliva of practically healthy individuals using the microvariation of the reaction was 528.6 ± 2.4 U / l. In conclusion the use of a microvariant of the reaction for determining the activity of alpha-amylase may be justified for a large number of subjects. A linear dependence of the enzyme activity on its concentration in the range of 0-2.5 mg / ml is shown.

Full Text

Введение Многочисленными исследованиями показано снижение активности различных ферментов слюны при патологических процессах в пародонте и твердых тканях зуба. Альфа-амилаза не является исключением [1, 2]. Известно, что от концентрации ферментов в сложных биологических растворах может зависеть их каталитическая активность. Изучение этой концентрации необходимо для определения степени тяжести стоматологической патологии и выбора правильной стратегии лечения [3]. Большинство способов определения каталитической активности альфа-амилазы основано на детекции способности фермента расщеплять субстрат, а именно крахмал, так как альфа-амилаза гидролизует 1,4-гликозидные связи в молекулах сложных углеводов [4]. Однако известны и другие подходы к оценке активности альфа-амилазы. Ряд авторов используют определение количества газа, выделяющегося в процессе реакции (манометрический метод), или фиксируют изменение оптического вращения (поляриметрический метод). Для количественного определения расщепленного ферментом субстрата (крахмала) применяют фотометры, которые позволяют изучить скорость ферментативной реакции по изменению поглощения субстрата при определенной длине волны [5]. Зачастую для реакций, входящих в данные методы, требуется большой объем реагентов и образцов, что затрудняет исследование слюны, особенно у большой группы людей одномоментно. С другой стороны, химическая промышленность выпускает альфа-амилазу в сухом виде, поэтому требуются методы определения каталитической активности растворов с различной концентрацией фермента при его растворении. Цель исследования - оценить возможность применения микроварианта реакции, определения активности альфа-амилазы слюны, а также проанализировать зависимость активности фермента от его концентрации. Материал и методы Активность альфа-амилазы определяли набором реагентов «АМИЛАЗА-ВИТАЛ» (Россия). Для экономии образцов и реагентов использовали полистироловый плоскодонный планшет для иммуноферментного анализа с объемом лунки 0,3 мл, а объем участников реакции пропорционально уменьшили. Дальнейшую процедуру анализа осуществляли согласно инструкции производителя. Для детекции окрашенного продукта применяли спектрофотометр PowerWave Х (США). Для определения концентрации альфа-амилазы использовали приготовленные ex tempore растворы альфа-амилазы (Россия) с концентрацией фермента 10; 5; 2,5; 1; 0,5 и 0,25 мг/мл соответственно. Пробы слюны в объеме 0,1 мл отбирали натощак у 15 человек в возрасте 20-25 лет с интактным пародонтом и зубным рядом без соматической патологии, согласно К.Н. Меньнику и соавт. [6]. Статистический анализ результатов выполняли с помощью t-критерия Стьюдента в программе Statistica 7.0. Результаты и обсуждение В первой серии экспериментов сравнивали результаты определения активности альфа-амилазы микропланшетным и классическим методами. Показано отсутствие статистически значимых различий (p > 0,05), что позволило нам использовать для дальнейших исследований только микропланшетный вариант. В ходе исследований выявлена прямая зависимость активности альфа-амилазы от следующих ее концентраций - 2,5; 1; 0,5; 0,25 и 0 мг/мл соответственно. Так, с увеличением концентрации фермента в 2 раза его каталитическая активность увеличивается более чем в 1,3 раза. Напротив, активность растворов фермента с концентраций выше 2,5 мг/мл начинает снижаться. Активность раствора альфа-амилазы с концентрацией фермента 5 мг/мл снижается более чем в 1,2 раза по сравнению с активностью данного фермента в концентрации 2,5 мг/мл. В свою очередь активность раствора с 10 мг/мл альфа-амилазы снижается более чем в 1,5 раза по сравнению с активностью данного фермента в растворе с концентрацией 5 мг/мл. Известно, что у здоровых людей активность альфа-амилазы слюны составляет в среднем 530 Е/л [7]. При использовании микропланшетного варианта реакции установлено, что активность фермента у 15 доноров с интактным пародонтом и зубным рядом без соматической патологии - 528,6 ± 2,4 Е/л. В целом, на современном этапе развития медицинской науки все большее предпочтение отдается микрообъемным вариантам классических реакций. Подобная ситуация позволяет увеличивать группы обследуемых лиц, проводить исследования одномоментно, а также использовать компьютерную обработку результатов. Предлагаемый микровариант реакции определения активности альфа-амилазы обладает всеми вышеперечисленными характеристиками. В ходе исследований показано, что в диапазоне концентрации альфа-амилазы 0-2,5 мг/мл ее активность нарастает, а при дальнейшем увеличении количества фермента его активность снижается. Подобное явление может быть обусловлено меньшей растворимостью насыщенного раствора и выпадением фермента в осадок, что необходимо учитывать при приготовлении растворов альфа-амилазы. Заключение Таким образом, показано, что предлагаемый микровариант определения активности альфа-амилазы может быть использован наряду с классическим вариантом реакции, обладает рядом преимуществ за счет увеличения числа проб для одномоментного исследования и снижения объемов, используемых реагентов. Выявлен диапазон концентраций альфа-амилазы (0-2,5 мг/мл), когда наблюдается прямая зависимость с активностью фермента.
×

About the authors

A. P Godovalov

Acad. E.A. Wagner Perm State Medical University

614000, Perm, Russia

M. V Yakovlev

Acad. E.A. Wagner Perm State Medical University

Email: mikhailyak@mail.ru
614000, Perm, Russia

I. I Zadorina

Acad. E.A. Wagner Perm State Medical University

614000, Perm, Russia

References

  1. Feng Y., Li Q., Chen J., Yi P., Xu X., Fan Y., et al. Salivary protease spectrum biomarkers of oral cancer. Int J. Oral Sci. 2019;11(1): 7.
  2. Zhang Q., Chen B., Zhu D., Yan F. Biomarker levels in gingival crevicular fluid of subjects with different periodontal conditions: A cross-sectional study. Arch. Oral Biol. 2016; 72: 92-8.
  3. Максутова В.О., Цветков В.О., Шпирная И.А., Ибрагимов Р.И. Определение активности амилолитических ферментов по гидролизу субстрата, иммобилизованного в полиакриламидном геле. Доклады Башкирского университета, 2017; 295): 736-40.
  4. Садовничий В.А., Ветров Д.П., Вишневский В.В. и др. Математический метод определения каталитической активности ферментов в сложных биологических растворах. Интеллектуальные системы. Теория и приложения (ранее: Интеллектуальные системы по 2014, № 2, ISSN 2075-9460). 2013; 17(1-4. - С.): 517-22.
  5. Яковлев М.В., Батог К.А. Изучение антибиопленочной активности альфа-амилазы. Материалы XVII научной конференции молодых ученых и специалистов с международным участием «Молодые ученые - медицине». Владикавказ; 2018: 339-41.
  6. Мельник К.Н., Баишева Г.М., Гильмиярова Ф.Н., Аллатова Т.А. Саливадиагностика как метод определения иммунологической адаптации к учебному стрессу в условиях различного питьевого поведения. Клиническая лабораторная диагностика. 2018; 63(6): 353-7.
  7. Биохимия ротовой жидкости в норме и при патологии. Учебно-методическое пособие. Под ред. Шестопалова А.В. /ФГБОУ ВО РНИМУ имени Н.И. Пирогова Минздрава России. М.: ИКАР; 2017.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2019 Eco-Vector


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 86295 от 11.12.2023 г. 
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ЭЛ № ФС 77 - 80635 от 15.03.2021 г.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies