OCTACALCIUM PHOSPHATE. THE METASTABLE PHASE OF MINERALIZATION OF ORGANIC APATITES

Full Text

Снижение сроков реабилитации больных после хирургических вмешательств является важной и всегда актуальной задачей. Основная цель разработок - достижение максимального соответствия свойств тканей, образующихся de novo. Перспективна для этой цели пористая кальций-фосфатная керамика, поскольку минеральная составляющая костной ткани представлена в основном биологическим апатитом (БАП) (Ca, Na, Mg)10(PO4HPO4, CO3)6(OH, F, Cl). Больше внимания уделяется бифазной керамике в системе гидроксиапатит-трикальцийфосфат (ГАП-ТКФ), карбонатсодержащего гидрок-сиапатита (КГАП) и октакальциевого фосфата (ОКФ) [21]. Последнему в нашей стране [1] и за рубежом [55] уделяется много внимания. ОКФ является метастабильной фазой, прекурсором (предшественником) в формировании БАП. Данный обзор посвящен физико-химическим свойствам прекурсора ОКФ как необходимой метастабильной фазы в формировании БАП. Структура октакальций фосфата Стехиометрический состав ОКФ соответствует формуле Ca8(HPO4)2(PO4)6 · 5H2O с атомарным соотношением Ca/P = 1,33. Структура ОКФ имеет слои, схожие со слоями ГАП (слой А), разделенные гидратированными слоями (слой В), содержащими молекулы воды [12]. ОКФ является термодинамически метастабильной полиморфной модификацией ГАП [45]. Слои B содержат 2 типа групп (HPO)42-, одна из которых соединена со слоем А, а другая расположена между слоями А в конфигурации (CaHPO4)Ca [54]. Это позволяет предположить вхождение в ОКФ других ионов путем ионного обмена с группами (HPO)42-. Способность ОКФ обратимо менять содержание ионов (HPO)^ гидратированных слоях B приводит к изменению рН среды от щелочной до нейтральной [65]. Структура порошка ОКФ имеет вид плоских кристаллов типа “розеток”, Гурин Алексей Николаевич - канд. мед. наук, тел. 8(499) 246-13-34, e-mail:gurin.alex@gmail.com ориентированных по плоскостям {100} вдоль оси симметричной “а”-триклинной структуры, находящейся между плоскими кристаллами апатита (рис. 1). Синтез ОКФ ОКФ синтезируют в основном двумя способами - осаждением из водных растворов и гидролизом ортофосфатов бруши-та - CaHPO4 · 2H2O или a-Ca3(PO4)2 (α-ТКФ) [51, 70]. 100% пик содержания ОКФ наблюдается при 4,8° по шкале 2Θ (рис. 2). При исследовании изотермического растворения в зависимости от pH показано, что ОКФ занимает промежуточное положение между ГАП, β-ТКФ, дикальций-фосфат-дигидратом (ДКФД) и дикальций фосфатом (ДКФ). ОКФ - термически неустойчивое соединение, разлагающееся в условиях более низких температур, чем при спекании керамики. Потеря воды в ОКФ начинается при температуре 80°C, при 180°C нарушаются связи между слоями в структуре ОКФ, а при 300°C ОКФ трансформируется в пирофосфат [3]. Гидролиз ОКФ БАП формируется через метастабильную фазу ОКФ [20, 32, 68]. Переход ОКФ ^ ГАП в организме может происходить в результате непрерывного гидролиза in situ либо по механизму растворения ОКФ и осаждения ГАП из перенасыщенного раствора, причем превращение ОКФ в ГАП необратимо [61, 65]. Гидролиз сопровождается присоединением к молекуле ОКФ ионов кальция из раствора и переходом части фосфат-ионов в раствор [13]. При гидролизе нестехиометрического ОКФ с соотношением Ca/P = 1,26 образуется ГАП с соотношением Ca/P = 1,49 [47]. Проблема гидролиза ОКФ важна в связи с гипотезой биоминерализации, согласно которой образование стабильной в организме фазы - БАП включает стадию формирование промежуточной метастабильной фазы - ОКФ. Инициаторы и ингибиторы формирования ОКФ Поскольку костный матрикс содержит различные ионы, то вполне возможно их влияние на гидролиз ОКФ. В эксперименте in vitro при высоких концентрациях Mg2+(> 104 4 экспериментально-теоретические исследования а Рис. 1. Схематическая связь между кристаллами ОКФ и апатитом в структуре ОКФ/апатит; ОКФ и апатит ориентированы по плоскостям {100} [32]. мкМ) продуктом гидролиза брушита может быть не ОКФ и ГАП, а β-ТКФ [46]. Изучено влияние 5 и 10 мкМ ионов различных металлов на гидролиз брушита до ОКФ и ГАП в растворе ортофосфорной кислоты с добавлением нитрата металла. Сильное ингибирующее действие оказывали ионы Cu2+, ионы Pb2+ усиливали гидролиз; ионы Mg2+ оказывали слабое ингибирующее действие, а ионы переходных металлов Cr3+, Fe2+, Fe3+ являлись соответственно ингибитором, слабым ингибитором и слабым активатором. Двухвалентные ионы железа и цинка полностью подавляли превращение брушита в ГАП. Механизм ингибирующего действия связывают с адсорбцией ионов, препятствующих минерализации. Исследовали действие различных концентраций фтора на морфологию кристаллов ОКФ и переход ОКФ в БАП на модельной мембранной системе факторов роста кристаллов зубной эмали [32]. В отсутствие фтора образуются широкие ленточные кристаллы размером около 100 мкМ. При добавлении 0,1 мг/л F- начинает проявляться структура преимущественно ОКФ. При концентрации 1 мг/л F-, по данным фазового анализа, преобладающей фазой являлся апатит с небольшим количеством ОКФ. При концентрации фторид-ионов 2 мг/л преобладает формирование кристаллов БАП игольчатой формы длиной около 1 мкм. Как полагают авторы, фтор стимулирует переход ОКФ в ГАП. ГАП не образуется de novo в ультрафильтрате сыворотки крови, что, по-видимому, связано с наличием в крови физиологических ингибиторов роста кристаллов ГАП [14]. Эти результаты дали толчок новым исследованиям, в которых рассматривалось влияние физиологических концентраций пирофосфата (P2O7)4- на скорость роста кристаллов ФК на ОКФ и ГАП [22, 23], что подтверждает работа [14], когда сдерживание роста ГАП непосредственно ведет к формированию кристаллов ОКФ. Некоторые неорганические ионы, такие как пирофосфат, ингибируют минерализацию. Предполагают их роль в регуляции этого процесса [25, 48]. Приведены доказательства того, что циркулирующий в плазме гликопротеин-1 клеточных мембран, продуцирующий пирофосфат, взаимодействует с тканеспецифичной щелочной фосфатазой, которая гидролизует пирофосфат и таким образом принимает участие в процессе регуляции биоминерализации [28]. Помимо крови слабой насыщенностью по ОКФ и пере-сыщенностью по ГАП характеризуется синовиальная жидкость [58], десневая жидкость [53, 67], человеческая слюна [26, 59], эмаль на ранней стадии амелогенеза у свиней [5], а также жидкость эпифизарного хряща у крыс [30]. Ионы магния подавляют рост кристаллов группы ФК [44, 70]. Образование ФК ускоряется, во-первых, степенью перенасыщения раствора, которая определяется концентрациями кальция и фосфата, а также значением pH раствора, и, во-вторых, концентрацией ионов фтора, являющихся специфическими индукторами минерализации [5, 73]. Механизм, лежащий в основе биоминерализации, должен быть исследован с учетом всего комплекса воздействующих факторов торможения и индукции. У животных in vivo при повышенном содержании F- или {100} а ОКФ Рис. 2. Дифрактограмма ОКФ (а) и ГА (б). Характерной особенностью ОКФ, отличающей его от других, является пик 4,8°. дефиците Mg2+ и в наблюдениях in vitro F- ускорял, а Mg2+ замедлял гидролиз ОКФ в ГАП, что позволило предположить роль ОКФ как наиболее вероятного кислого прекурсора ФК при формировании эмали зуба. Высокие концентрации Mg2+ и CO3 в межклеточной жидкости, окружающей формирующиеся кристаллы эмали в ходе амелогенеза у свиней влияли на рост кристаллов [6]. В частности, Mg2+ сильно замедляет рост кристаллов эмали, поскольку он конкурирует с Ca2+ за точки роста на поверхности кристаллов. Mg2+, а также F- и (CO3)2- сдерживают продольный (вдоль оси «с”) рост кристаллов ОКФ, зарождающихся на катионно-селективных мембранах [31]. В ходе формирования эмали ОКФ-подобные прекурсоры изначально растут в узкой зоне, примыкающей к амелобластам в виде маточных кристаллов, с последующим разрастанием апатитов на ОКФ в более глубоких удаленных от клеточного слоя областях [7]. При ранней стадии отложения зубного камня Mg2+ присутствует в областях, состоящих из витколита, иногда с примесью апатита и отсутствует в отложениях ОКФ [43]. Цинк, повсеместно распространенный катион, необходимый для правильного функционирования энзиматических путей, присутствует в относительно высоких концентрациях в кальцифицированных участках костного матрикса. Цинку, по-видимому, принадлежит важная роль, поскольку благодаря ему ОКФ становится первой кристаллической фазой в костной структуре. Если выдерживать ОКФ в синтетической хрящевой лимфе, то цинк замедляет его переход в ГАП. Возможно, стабилизирующий эффект цинка на ОКФ связан с заменой Ca2+ в решетке кристаллов ОКФ, расположенных на поверхности отложений матрикса. Эта замена стабилизирует решетку от преобразования in situ в более апатитоподобную структуру. Влияние ОКФ на минерализацию Молярное отношение кальция к фосфору используется как один из критериев определения конкретной химической формы ФК. Молярные отношения кальция к фосфору отражают стехиометрические композиции указанных ФК. Показано, что молярное отношение кальция к фосфору может колебаться от 1,15 до 1,5 [19, 72]. Чтобы объяснить отсутствие стехиометрии биоминералов, было высказано предположение, что ФК с меньшим молярным отношением кальция к фосфору, чем у ГАП, образуются раньше последнего и затем лишь трансформируются в ГАП. В качестве таких предполагаемых предшественников рассматриваются ДКФД, аморфный фосфат кальция и ОКФ [14, 20, 24, 48, 61]. ОКФ подобен ГАП и дифференцировать его с последним в составе кристалла затруднительно [48]. 5 РОССИЙСКИЙ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, №3, 2012 Известно, что везикулы внеклеточного матрикса представляют собой центры, в которых берут начало процессы кальцификации в костной ткани [4, 11]. Исследования с использованием метода дифракции рентгеновских лучей показали, что изолированные везикулы матрикса содержат аморфные компоненты, однако аморфный ФК обнаружен в них не был, он присутствует в аморфном компоненте фосфо-липидных комплексов, содержащих неорганический кальций и кислые фосфаты [71]. Таким образом, вопросы существования предшественников биоминералов продолжают обсуждаться. В настоящее время ОКФ считается биологически важным предшественником по следующим причинам: • центральный дефект, называемый центральной темной полосой, который с помощью электронной микроскопии можно наблюдать в центральной части кристаллов эмали, рассматривается как 1 или 2 структурные единицы исходно формирующихся кристаллов ОКФ [32, 49, 56, 61]; • амелогенин, представляющий собой белок матрикса зубной эмали, определяет морфологию кристалла путем адсорбции на поверхности ОКФ в процессе удлинения кристаллической структуры и придает ей в высокой степени упорядоченный вид [52]. На ранней стадии минерализации эмали человека (27 нед) в органическом матриксе можно наблюдать 2 белковые цепочки, на которых происходит осаждение минералов [2]; • по мере созревания кристаллов их размеры увеличиваются, в центре появляется светлая полоска, которая исчезает при полностью сформированном кристалле; возможно, первичная минерализация и представлена одним из прекурсоров фосфатов кальция [2]; • исследования кинетики показали, что ультрафильтрат сыворотки человека имеет состав, вполне допускающий трансформацию ОКФ в ГАП [24]. С возрастом содержание кальция увеличивается, а содержание фосфора уменьшается, что ведет к изменению их молярного соотношения. Кислый фосфат HPO42-, рассматривается как индикатор кислых предшественников ГАП, и по мере минерализации его содержание уменьшается [14]. Это хорошо просматривается на эмбриональной эмали. На вестибулярной поверхности различают: развивающуюся эмаль, что соответствует краевой эмали; созревающую эмаль; среднюю и зрелую эмаль около режущего края [2]. В соответствии со структурой ОКФ, впервые предложенной M. Mathew и соавт. (1988), существуют две различающиеся кислофосфатные группы: одна находится в пределах водного слоя, другая - на границе слоев апатита и воды [47]. Проведенный авторами анализ нестехиометрических, дефицитных по кальцию кристаллов ОКФ, содержащих 40% общего содержания фосфата в виде кислых фосфатов, показал, что кислые фосфаты, входящие в состав ОКФ, делятся на 3 категории: 1) стабильные фосфаты, составляющие приблизительно 50-60% от общего их содержания и, возможно, представляющие собой преимущественно кислофосфатные ионы, расположенные на границе слоев апатита и воды; 2) обратимо изменяющиеся фосфаты, на 25-30% состоящие из кислых фосфатов, которые могут находиться либо в водном слое, либо на поверхности кристалла; 3) нестабильные (необратимо отщепляющиеся) фосфаты, на 15-20% состоящие из кислых фосфатов. Кислые фосфаты, относящиеся к категориям стабильных и обратимо изменяющихся фосфатов, составляют около 33% от общего содержания фосфора, что приближается к значению, ожидаемому, исходя из стехиометрии ОКФ. Результаты рентгеновского дифракционного анализа свидетельствуют о том, что большая часть обратимо изменяющихся кислых фосфатов содержится внутри кристаллов, поскольку уменьшение концентрации кислых фосфатов приводит к сжатию кристаллической решетки. Полученные данные указывают на возможность обратимых изменений внутренней структуры ОКФ непосредственно перед началом гидролиза, который сопровождается значительным снижением содержания кислых фосфатов. Подобные возрастные изменения обычно наблюдаются в развивающихся биоминералах и могут включать в себя образование предшественников еще до непосредственного осаждения ГАП [7, 15, 20]. Также была проанализирована кристаллическая структура ОКФ, которая представляет собой чередование слоев апатита и водных прослоек [12]. Таким образом, переход ОКФ в ГАП может происходить следующим образом: 1) in situ путем гидролиза при участии слоев апатита; 2) de novo путем осаждения кристаллов апатита на кристаллах ОКФ, в результате чего ОКФ растворяется [14]. Отмечено, что переход ОКФ в ГАП является термодинамически выгодным процессом и, однажды начавшись, в дальнейшем протекает спонтанно и необратимо. Гидролиз сопровождается захватом кальция из окружающей среды и выбросом в раствор фосфат-ионов. Исследования, имитирующие процесс гидролиза in vitro, показали, что ионы HPO42- могут мигрировать как внутрь, так и за пределы кристаллической решетки ОКФ в процессе образования ГАП [64]. Восстановление костной ткани при использовании ОКФ Показана возможность заполнения костных дефектов материалами на основе ОКФ для остеорепарации [9, 34, 36-40, 62, 63]. С помощью микролучевой методики рентгеновской дифракции было показано, что имплантированный ОКФ трансформируется в апатит [62, 64]. При имплантации синтетического ОКФ в крупные дефекты костной ткани крыс регенерация кости начиналась как у краевой зоны дефекта, так и на части имплантата, удаленной от краевой зоны, что свидетельствовало о том, что ОКФ представляет собой центр, вокруг которого происходит инициация репара-тивного процесса [38]. Новообразованный костный матрикс вокруг имплантированного ОКФ содержит коллаген I типа [57], а также остеокальцин [39], каждый из которых является специфическим белком костной ткани [37, 69]. Рядом авторов было показано, что имплантированный ОКФ резорбируется многоядерными гигантскими клетками [35, 36]. При имплантации в костный мозг крыс ОКФ и ГАП окружались такими клетками. На имплантированном ОКФ цитоплазма многоядерных гигантских клеток в зоне контакта формировала ребристую область в виде «щеточной каемки», а также светлую зону, проявляя ультраструктурные характеристики, свойственные остеокластам, и выполняя их функцию, что способствовало активной резорбции материала. На имплантированном ГАП многоядерные гигантские клетки формировали светлую зону, при этом «щеточной каемки» в приграничной области не обнаруживалось. Поверхность имплантированного ГАП в зоне контакта с полинуклеарными клетками оставалась гладкой и резорбции не подвергалась. Остеокласты трубчатых костей кроликов способны ре-зорбировать синтетический карбонат-апатит, но не способны резорбировать синтетический ГАП [17, 18]. Поскольку содержание карбоната в апатите, трансформировавшемся из имплантированного ОКФ, не определялось, истинная природа апатита, формируемого из имплантированного ОКФ, не выяснена. Тем не менее с тех пор, как стало ясно, что введение в кристалл таких примесей, как карбонат-ион, происходит на стадии гидролиза ОКФ [16], выглядит вполне вероятным, что апатит, формирующийся на основе имплантированного ОКФ, представляет собой карбонат-апатит. Для оценки истинного состава кристалла необходим химический анализ имплантированного ОКФ. В эксперименте с созданием краниального костного дефекта у крыс оценивались процессы регенерации костной ткани, а также резорбции ОКФ, β-ТКФ и ГАП после имплантации через 6 мес [39]. Статистический анализ показал, что процент оставшегося в имплантированном материале ОКФ достоверно меньше, чем ГАП и подверженного биологической резорбции β-ТКФ. При этом объем новообразованной кости в дефекте, заполненном ОКФ, был достоверно больше, чем при имплантации ГАП или β-ТКФ [33, 42, 60]. Изучали реакцию костной ткани на дырчатые дефекты бедренной кости крыс диаметром 3 мм в области прок 6 экспериментально-теоретические исследования симального метафиза при заполнении их гранулами ОКФ, частичным гидролизатом ОКФ с низкой кристалличностью (Ca/P = 1,37), полным гидролизатом ОКФ и керамическими гранулами β-ТКФ [50]. Все образцы были микропористыми. Неполный гидролизат ОКФ с низкой кристаллизацией активнее стимулирует образование новообразованной костной ткани по сравнению с полным гидролизатом ОКФ. Неполный гидролизат ОКФ подавляет активность остеокластов, окрашенных на кислую фосфатазу и катепсин-К, а также подавляет маркеры воспаления IL-ß1 и TNF-α. Авторы отмечают, что ОКФ позволяет разрабатывать на его основе материалы, приближающиеся к аутокости. На краниальных дефектах черепа у крыс исследовали действие ОКФ и его гидролизата со сроками наблюдения 4 и 12 нед [65]. Процент прироста новообразованной костной ткани для ОКФ был статистически достоверно выражен через 12 нед по сравнению с его гидролизатом. Проведение рентгенофазового анализа имплантированного ОКФ в критический дефект крыс через 10 и 21 день показало, что характерный для обычного ОКФ пик отражения при 4,8° (2Θ), относящийся к плоскости {100} постепенно уменьшается к 21-му дню, что указывает на конверсию ОКФ в апатит in vivo. Изучали влияние на регенераторные процессы костной ткани крыс при имплантации ОКФ и композита ОКФ-коллаген с различной концентрацией ОКФ и коллагена [41]. Моделью служили критические дефекты черепа крыс диаметром 9 мм. Исследуемый материал прессовали в таблетки диаметром 9 мм и помещали в дефект со сроками наблюдения 4 и 12 нед. Радиографический анализ показал, что максимальная плотность костной ткани наблюдается на композите ОКФ-коллаген в соотношении 83/17. Это подтвердил морфометрический анализ гистологических срезов. Оценка клеточной адгезии на ОКФ и композите ОКФ-коллаген выявила, что чем меньше концентрация ОКФ, тем клеточная адгезия выше. Такая же зависимость наблюдается при изучении пролиферации стромальных клеток костного мозга мышей ST-2 на изучаемых дисках: при уменьшении концентрации ОКФ пролиферация клеток ST-2 возрастала. Авторы отмечают, что композит ОКФ-коллаген в соотношении 83/17 - оптимальный материал для восстановления костной ткани. Пористый танталовый имплантат, покрытый биомиме-тическим ОКФ, индуцировал кость в мышце козы, тогда как кость не формировалась, когда имплантат был покрыт кар-бонатгидроксиапатитом [10]. Кость образовывалась внутри пор и никогда на необработанной поверхности имплантата. Аналогичные результаты получены на титановых имплантатах (Ti6A14V), обработанных ОКФ [27]. ОКФ проявляет в биологическом микроокружении постоянную вторичную остеоиндуктивность, т. е. способность инициировать образование костной ткани de novo, например при подкожном имплантировании [65, 66]. Такое поведение ОКФ трудно объяснить. Однако в ранних исследованиях [62, 63] было установлено, что синтетический ОКФ, имплантированный в свод черепа крыс субпериостально и подкожно, показал образование новообразованной кости только в суб-периостальной области черепа, тогда как при подкожной имплантации не привел к формированию новой кости. Этот результат говорит о том, что необходимы факторы, не связанные с имплантатом, но обязательные для формирования новой кости на биологическом апатите, которые присутствуют в субпериостальной области и отсутствуют в мягких тканях. Тем не менее состав ОКФ не является решающим фактором для остеоиндуктивности. По-видимому, вторичная остеоиндуктивность различных материалов связана с их способностью концентрировать на своей поверхности морфогенетические белки из окружающей среды. Специфическая способность ОКФ адсорбировать белки, возможно зависит от наличия микропор между кристаллами, что влияет на адгезию остеобластов. Гидролиз ОКФ в ГАП может быть одним из факторов, стимулирующих дифференцировку мультипотентных стволовых клеток в остеобласты. Этот переход ОКФ в ГАП в костном дефекте крысы подтверждался в рентгеновских микродифракционных исследованиях [66]. ОКФ выполняет не только роль источника Ca2+ и фосфора, но также функцию базиса, на котором формируется костная ткань. Со временем он резорбируется остеокластами или гигантскими многоядерными клетками, которые в контакте с ОКФ трансформируются и выполняют функцию остеокластов [36]. Скорость резорбции ОКФ значительно превышает резорбцию ГАП и ТКФ. После 6 нед имплантации в костный дефект крысы ОКФ практически полностью исчезал в отличие от ТКФ и, особенно, ГАП, а количество новообразованной костной ткани было максимально для ОКФ. На модели in vitro стромальных клетках костного мозга крысы показано, что ОКФ вызывает повышенную экспрессию остеогенных маркеров, тогда как у ГАП данный эффект не обнаружен [29]. ОКФ индуцирует дифференцировку стромальных клеток в остеобласты, участвующие в формировании костной ткани [65]. Авторы данного обзора создали технологию реакционносвязанных фосфатов кальция в системе ОКФ - α-ТКФ. Изготовлены экспериментальные образцы в виде гранул, содержащие основную фазу - аморфный апатит, α-ТКФ и ОКФ. Предполагаемое биологическое поведение данного материала можно представить следующей схемой: на первом этапе происходит активация остеогенеза через ОКФ и растворение аморфной фазы, приводящие к увеличению пористости для инфильтрации тканевой жидкости и клеточных элементов; далее происходит постепенное растворение кристаллической фазы α-ТКФ, согласующееся с процессами остеогенеза. Таким образом, анализ данных литературы показал, что материалы на основе ОКФ являются вторичными остеоиндукторами. Это дает возможность создавать новые перспективные остеопластические материалы для замещения костных дефектов с уникальными свойствами.

About the authors

A. N Gurin

Email: gurin.alex@gmail.com

Yu. A Petrovich

V. S Komlev

I. V Fadeeva

S. M Barinov

References

Supplementary files