EXPERIMENTAL-THEORETICAL SUBSTANTIATION OF PRINCIPLES AND FEATURES OF APPLICATION OF THE METHOD OF LASER-CONVERSION DIAGNOSTIC ASSESSMENT OF THE STATE OF TOOTH HARD TISSUES IN NORM AND IN PATHOLOGY (CARIES)

Full Text

Введение. В настоящее время кариес зубов несмотря на широкое применение различных современных методов диагностики и лечения — наиболее распространенное заболевание, охватывающее почти 100% населения. Однако существующие методы в основном являются визуальными и имеют серьезный недостаток, не выявляя в режиме реального времени ведущий этиологический фактор при кариесе — микробный, и не позволяют качественно и количественно мониторировать патогенетический процесс — деминерализацию твердых тканей зуба микробной этиологии [1]. В связи с этим разработка новых экспресс-методов диагностики, лечения, профилактики, наблюдения и объективизации состояния твердых тканей зуба в норме и при патологии остается актуальной. Одним из наиболее перспективных направлений в стоматологии является использование лазерного излучения и лазерной медицинской техники. Инновационный экспресс-метод лазерно-конверсионной диагностики (ЛКД) является аналитическим методом выявления и измерения концентрации микробов, позволяющим проводить индикацию биологических объектов при малых концентрациях [2], выявлять качественно и количественно деминерализацию твердых тканей зуба микробной этиологии (М. Т. Александров, 2013). В перспективе — разработка новых методов диагностики и лечения в стоматологии, в том числе контроля ведущего патогенетического процесса — деминерализации твердых тканей зуба на различных этапах диагностики и лечения [3]. Концепция нашего исследования основана на том, что новейшие медицинские технологии диагностики и лечения должны позволять проводить: — экспресс-диагностику кариеса, — объективизировать его лечение, — осуществлять ускоренное исследование микробной ассоциации — основного этиологического фактора — непосредственно в условиях клиники, т. е. проводить анализ по месту лечения в масштабе реального времени. Цели и задачи Цель работы — провести экспериментально-теоретическое обоснование повышения эффективности патогенетической диагностики и лечения кариеса зубов, применяя экспресс-метод лазерно-конверсионной диагностики (рамановское рассеяние при оптимальных параметрах флюоресценции). Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: • Изучить спектр действия лазерного излучения оптического диапазона с длиной волны 637 нм (красный диапазон лазерного излучения), 532 нм (зеленый диапазон лазерного излучения), 405 нм (синий диапазон лазерного излучения) для эффективной патогенетической диагностики кариеса. • Проанализировать возможности рамановского рассеяния и флюоресценции как базовых компо нентов ЛКД для исследовании этиологии, патогенеза (качественно и количественно определить степень минерализации/деминерализации твердых тканей), этапов клинического течения и лечения кариеса зубов. • Исследовать интактные и кариозно-измененные твердые ткани зуба с помощью метода ЛКД (флюоресценции и рамановского рассеяния). • Определение перспектив клинического применения. Материалы и методы Для исследования использовали аппаратно-программный комплекс ИнСпектр (рис. 1 на вклейке) и метод раманфлюо-ресцентной диагностики. Рамановское (неупругое) рассеяние света обусловлено неупругими столкновениями световых квантов (фотонов) с нейтральными возбуждениями исследуемого вещества. При таком столкновении спектр рамановского рассеяния органических и неорганических молекул состоит из линий, отвечающих деформационным и валентным колебаниям химических связей углерода с другими элементами, как правило, водородом, кислородом и азотом, а также характеристическим колебаниям различных функциональных групп (гидроксильной -OH, аминогруппы -NH2 и т. д.). Поскольку в органических и неорганических молекулах имеется большое количество вращательных и колебательных степеней свободы, то они все проявляются в спектре рамановского рассеяния света в виде набора линий, каждая из которых характеризуется индивидуальным спектральным положением и относительной интенсивностью. Именно этот набор спектральных характеристик дает возможность говорить о рамановском "отпечатке пальцев" органической или неорганической молекулы и позволяет проводить анализ веществ, а также расшифровывать состав смесей многих веществ [4]. Таким образом, из набора возбужденных состояний, измеренных по спектру рассеянного света, можно сделать заключение о природе молекул, из которых состоит исследуемое вещество [5]. Методика исследования на удаленных зубах Исследование in vitro проводили на 64 свежеудаленных по клиническим показаниям зубах (резцов, клыков, премоляров и моляров) с кариозным процессом различной локализации, были изготовлены 4 модели с равным количеством зубов и аналогичными кариозными полостями. По 5-му классу (по Блэку) было изучено 16 полостей, по 4-му классу — 12 полостей, по 3-му классу — 12 полостей, по 2-му классу — 18 полостей, по 1-му классу — 28 кариозных полостей. Показатели флюоресценции получали до обработки кариозной полости, на этапах препарирования, после окончательного препарирования. Завершающую (медикаментозную) обработку кариозной полости осуществляли традиционным методом. Работу выполняли в 3 этапа: 1-й этап — исследование спектра действия лазерного излучения (405 нм — синий свет, 532 нм — зеленый свет, 637 нм — красный свет) для эффективной и объективной оценки состояний тканей зуба в норме и при патологии (кариес); 2-й этап — применение раман-флюоресцентной диагностики (РФД) для оценки степени минерализации (деминерализации) в норме и при патологии (кариес); 3-й этап — оценка возможностей и перспектив применения разработанной аппаратуры и медицинских технологий экспресс-оценки состояний твердых тканей зуба в норме и при патологии (кариес). 7 РОССИЙСКИЙ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, №4, 2013 Результаты и обсуждение Для подтверждения диагностической информативности и эффективности (по спектральной специфичности квантового выхода) зондирующего излучения с различной длиной волн (синий, красный и зеленый лазер) непосредственно для твердых тканей зуба проведено сравнительное исследование. Для этих целей интактную эмаль и кариозные полости исследовали методом раман-флюоресцентной диагностики с использованием зондирующего излучения с длинами волн — 405 нм (синий), 532 нм (зеленый), 637 нм (красный). Как известно, возбуждающее излучение в исследуемом объекте сосредоточивается и рассеивается на разной глубине в зависимости от длины волны этого излучения (к примеру, синий лазер возбуждает близкие к поверхности участки, красный проникает глубоко внутрь). К тому же каждая длина волны может резонансно возбудить люминесценцию какого-нибудь химического соединения или бактерий. В связи с этим и множеством других факторов требуется вначале выбрать правильную длину волны возбуждающего лазера, которая даст наиболее контрастную и информативную картину и позволит выявлять отличия между зубами в норме и при патологии. Анализ данных и снятые спектры, полученные в результате исследований тканей, возбужденных разными лазерами, приведены на рис. 2 (на вклейке) и в таблице. Как видно из приведенных в таблице данных, наиболее информативными являлись спектрограммы, полученные после воздействия на твердые ткани зуба синим лазером (длина волны 405 нм). Именно в этом случае наблюдали наибольшее число изменений количественных показателей в ЛКД-графиках, объективно и многофакторно характеризующих изменения твердых тканей зуба при кариесе. Эти отличительные показатели следующие (по отношению к интактным тканям): I — максимальная интенсив ность флюоресценции, □ 1 и □ — длины волн на по-лувысоте пика флюоресценции, в нм; □ - □1 — полуширина пика флюоресценции, S — площадь под кривой флюоресценции, I^/I — нормированный коэффициент ЛКД, сдвиг пиков флюоресценции □max — семь показателей существенного достоверного количественного отличия (для других длин волн зондирующего излучения таких отличий не более 2). Все это определило выбор зондирующего излучения — 405 нм для диагностики (в широком медицинском смысле слова) и оценки состояния твердых тканей зуба в норме и при кариесе. Результат исследования бактерий с помощью ра-мановского рассеяния выявил существенные новые закономерности: бактерии имеют свой индивидуальный, присущий только им ЛКД-спектр (диагностика видовой принадлежности микроба), независимый от возраста колоний и условий их культивирования. Кроме того, была выявлена эффективность и высокая чувствительность рамановского рассеяния не только для идентификации микроорганизмов, но и для выбора предпочтительного антисептического препарата (рис. 3). На рис. 3 представлены спектры с подложки для одинаковых концентраций синегнойной палочки, хлорамина и смеси хлорамина и синегнойной палочки (раствор 1:1). Видно, что после внесения хлорамина спектр синегнойной палочки исчез и спектр раствора хлорамин + синегнойка (1:1) стал очень похож на спектр хлорамина. Это означает, что бактерии "развалились" под действием данного антисептика. Таким образом, рамановское рассеяние позволяет быстро и надежно определять предпочтительный антисептический препарат. Также рамановское рассеяние может быть использовано для диагностики процессов деминерализации твердых тканей зуба (рис. 4, 5). Как видно из пред Сравнительный анализ использования для диагностики кариеса лазеров с различной длиной волны Лазер L фл □ 1, нм □2, нм □2 - □ полуширина S □ , нм max’ ГЯ фл кр Зеленый лазер верх 20 442 549 694 149 19 196 610 1,38 низ 20 573 548 693 145 19 260 1,39 кариес 21 171 548 717 169 22 922 1,18 интакт 20 642 548 690 142 19 433 1,39 Синий лазер верх 11 780 450 621 171 9512 507 1,26 низ 12 762 447 592 145 9727 1,27 кариес 13 843 508 732 224 15 573 635 3,87 интакт 12 194 448 609 161 9409 507 1,25 Красный лазер верх 60 251 695 752 57 73 802 707 3,54 низ 60 054 695 746 51 72 520 3,63 кариес 11 0481 695 748 53 137 985 3,86 интакт 60 134 694 746 52 72 054 707 01.03.59 Примечание. I — интесивность флюоресценции, в отн. ед.; □ и П2 — длины волн на полувысоте пика, в нм; П2 - □ — полуширина пика; S — интегральная интенсивность флюоресценции; □ — длина волны, которой соответствует максимальное значение интенсивности; Тф/! — отношение интенсивности флюоресценции к интенсивности комбинационного рассеяния воды. 8 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ставленных данных, спектр фторапатитов и гидрок-сиапатитов практически не отличались, спектр ин-тактной эмали зуба (окрашен зеленым цветом) идентичен спектру интактного цемента (окрашен синим цветом), хотя и раман у него ниже по интенсивности, что соответствует разнице количественного соотношения апатитов в твердых тканях зуба. Из представленных данных видно, что разработанная методика является патогенетической, так как она в экспресс-режиме способна выявлять как микробный фактор, так и степень деминерализации зуба под действием этого микробного фактора. Другая возможность этой методики — определение чувствительности ассоциации микробов, вызывающих кариес к антимикробным препаратам. Это позволит подбирать эффективный препарат для антисептической обработки полости рта. Выводы Таким образом, в научной работе показано, что медицинская технология лазерно-конверсионной диагностики (ЛКД) является экспрессным, неинвазивным, информативным методом диагностики и лечения кариеса зубов. Оптимальным параметром зондирующего излучения при ЛКД кариеса зубов является синий свет (длина волны 405 нм) как наиболее информативный: достоверно количественно имеет семь показателей отличия от других длин волн зондирующего излучения (имеющих не более 2 отличий) — I — интесивность флюоресценции, в отн. ед.; □1 и □ — длины волн на полувысоте пика, в нм; □2 - □1 — полуширина пика; S — интегральная интенсивность флюоресценции; □max — длина волны, которой соответствует максимальное значение интенсивности, в нм; I /I — отно- ’ ’ фл кр шение интенсивности флюоресценции к интенсивности комбинационного рассеяния воды. Применение разработанной технологии ЛКД позволяет количественно определять ведущий этиологический фактор кариеса зуба—микробный, осуществлять мониторинг течения заболевания, выбор индивидуального антисептического препарата, контролировать эффективность механической обработки кариозной полости зуба, качество пломбирования в динамике. Кроме того, применяя рамановское рассеяние можно определять относительную величину минерализации твердых тканей зуба, эффективность реминерализирующей терапии, проводить дифференциальную диагностику поражений твердых тканей зуба. Технология способствует в экспресс-режиме непосредственно у кресла пациента качественно и количественно диагностировать ведущий этиологический (микробный) фактор развития кариеса зубов, определять состояние твердых тканей зуба (минеральную составляющую в процентном соотношении), индивидуально выбирать эффективный антисептический дезинфектант, проводить мониторинг лечения и наблюдение в ближайшие и отдаленные сроки после лечения непосредственно в условиях стоматологической клиники. В клиническом плане возможно использование разработанной медицинской технологии для экспресс-оценки гигиены полости рта, кариесогенной ситуации, эффективности применения различных Рис. 3. Сравнительный анализ спектров антисептика 1% хлорамина при воздействии на штамм бактерии. Спектры: синий — хлорамина, красный — P. aeroginosa, зеленый — раствора хлорамина и P. aeroginosa. Рис. 4. Нахождение рамановских линий гидроксиапатитов и фторапатитов в интактном зубе, в меловом пятне и в эмали. Рис. 5. Снижение интенсивности рамановской линии гидрок-сиапатитов при развитии кариеса за счет падения степени деминерализации. Слева вверху цифрами указана интенсивность рамановских линий гидроксиапатитов (963 см-1) на каждом типе эмали (от 1 до 6 — эмаль ухудшается и интенсивность падает). 9 РОССИЙСКИЙ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, №4, 2013 профилактических средств (при кариесе и заболеваниях пародонта), диагностике и лечении осложнений кариеса, в том числе у лиц детского и подросткового возраста, мониторинга результата лечения в ближайшие и отдаленные сроки, также для видовой и количественной экспресс-идентификации микроорганизмов независимо от возраста колоний и условий их культивирования.

About the authors

M. T Aleksandrov

I.M.Sechenov First Moscow state University

S. V Zubov

I.M.Sechenov First Moscow state University

A. S Berezinskaya

"Medical centre"

V. I Kukushkin

Institute of solid state physics

H. E Pashkov

I.M.Sechenov First Moscow state University

O. N Ivanchenko

Polyclinic "Gazprom"

References

Supplementary files