Study of coordinated regulation of expression of tnfa and matrix metalloproteinases MMP8 and MMP9 in periodontal tissue in health and pathology

Full Text

Несмотря на широкое развитие инструментальных и лабораторных методов исследования, ранняя и точная диагностика различных стоматологических заболеваний до сих пор остается крайне актуальным вопросом. На протяжении многих лет заболевания па- родонта стабильно занимают по распространенности одно из ведущих мест в мире. Генетическая составляющая играет при этом одну из ведущих ролей [1], однако основной причиной хронического пародонти- та является инфицирование пародонта патогенными бактериями, приводящее к дисбиозу [2-4]. До настоящего времени отсутствуют данные литературы о результатах исследований, выполненных молекулярными методами, позволяющие судить о влиянии гендерных различий на состояние пародон- та и его защитных реакций, хотя последние работы [5, 6] косвенно свидетельствуют о вероятности существования такого влияния. Эффект половых гормонов эстрогена и прогестерона на ткани пародонта имеет длительную историю. Более 60 лет назад было обнаружено, что изменение гормонального статуса при беременности, пубертатном спурте и различных ста- Оригинальная статья диях менструального цикла существенно влияет на реакцию пародонта на зубной налет. Гингивит беременных, который встречается, по различным данным, у 35-100% женщин, немедленно прекращается после родов. Существует доказательство провоспалитель- ного эффекта половых гормонов, влияющих на продукцию простагландинов, проницаемость сосудов и скорость миграции нейтрофилов в тканях [7]. В настоящее время доказано, что эстроген также может давать защитный эффект в отношении пародонта, причем он не связан с изменением продукции цито- кинов и простагландинов. Однако наблюдение, показавшее, что при беременности увеличивается риск развития воспалительных заболеваний пародонта вне зависимости от уровня гигиены полости рта, остается наиболее убедительным подтверждением системного влияния половых гормонов на ткани пародонта [8]. Физиологически обусловленные изменения половых гормонов в значительной мере имитируются при использовании комбинированных оральных контрацептивов на основе прогестогена (1,5 мг в день) или этинилэстрадиола (30-40 мкг в день) [9]. Поскольку эти контрацептивы достаточно эффективны и получили массовое применение (например, в Великобритании их систематически принимают ~25% женщин в возрасте от 16 до 49 лет), рекомендуемая их дозировка несколько снижена. Примечательно, что Британский национальный формуляр не включает воспаление пародонта в число побочных эффектов этих препаратов. Его составители объясняют это решение тем, что оральные контрацептивы не способны влиять на здоровый пародонт, а только усугубляют воспаление, вызванное зубным налетом. Аналогичные решения приняты надзорными органами и в ряде других стран. При применении животных моделей установлено, что ответ хозяина является основным фактором разрушения пародонтальной связки при хроническом пародонтите [10]. Как системное, так и местное применение нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) приводит к подавлению синтеза про- стагландинов, вызывая снижение скорости разрушения альвеолярной кости при спонтанном поражении пародонта у собак и при наложении лигатуры на приматах. Аналогичным образом подавление продукции цитокинов фактора некроза опухоли альфа (ФНОа), интерлейкина-17 (ИЛ-17), комплемента и RANKL на модели деструкции пародонта при экспериментальной инфекции A. actinomycetemcomitans в условиях моделирования на приматах с помощью фистулы и наложения лигатуры привело к пониманию того, что все эти факторы непосредственно участвуют в разрушении пародонта [11]. Кроме того, в ходе этих исследований были предложены терапевтические средства для лечения пародонтита у человека. Напротив, искусственное введение ИЛ-1 или ФНОа, а также усиление их продукции в пародонте приводят к существенному ускорению лизиса костной ткани под действием микробного фактора [12]. Этому наблюдению соответствует и тот факт, что у трансгенных мышей с нарушенным синтезом ФНОа снижается скорость разрушения кости по сравнению с животными дикого типа. Данные об изменении состава транскриптома поверхности пародонта в норме и при обострении пародонтита, в частности увеличение концентрации ИЛ-1р, ИЛ-2, ИЛ-6 и ФНОа в кревикулярной жидкости при хроническом пародонтите по сравнению с нормой, достаточно многочисленны [11, 13, 14]. Однако недостатком опубликованных работ в этом направлении является практически полное игнорирование скорости изменения состава транскриптома. Очевидно, это объясняется практической сложностью взятия серий образцов у одного и того же пациента, хотя имеющиеся теоретические представления позволяют уверенно предсказать, что скорость реализации любых защитных реакций организма оказывает ключевое влияние на их эффективность. Именно с этой позиции стоит рассматривать многочисленные данные клинических исследований, подтверждающие устоявшуюся в литературе точку зрения об априорной неэффективности острого неспецифического иммунного ответа ТЫ-типа в плане предотвращения бактериальной инфекции пародонта и в конечном счете его разрушения с участием собственных клеток человека и его эндогенных протеолитических ферментов. Использование количественных, а не только качественных методов, позволивших применить статистический анализ выборок в норме и при патологии, является основной причиной того, что в рамках настоящей работы были обнаружены существенные различия в составе микробиоценоза между мужчинами и женщинами, а также различия в составе транс- криптов в тканях пародонта. Выявленная корреляция между концентрациями транскриптов ФНОа и ма- триксных протеиназ 8 и 9 (MMP8 и MMP9) у мужчин и лиц со здоровым пародонтом, но не у женщин, или в выборке пациентов с хроническим пародонтитом позволяет сформулировать новый подход к исследованию динамики синтеза защитных факторов, а также дает возможность пересмотреть утвердившееся в литературе представление о неэффективности и даже вредности острого неспецифического иммунного ответа ТЫ-типа с точки зрения предотвращения бактериальной инфекции пародонта. В обзорной статье зарубежных авторов [9] представлены результаты применения терапевтических блокаторов ФНОа для лечения болезней пародонта. Авторы приводят подтверждения того, что воспаление пародонта сопровождается нарушением баланса противовоспалительных цитокинов: ИЛ, ФНОа, про- стагландинов и цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10. Исследования на животных моделях указывают на то, что ФНОа играет важную роль в патогенезе пародонтита, а его блокаторы пентоксифиллин и талидомид способны замедлять разрушение пародонтальной связки. Исследования на животных показали, что ФНОа наряду с другими цитокинами отвечает за прогрессирование гингивита и переход его в пародонтит. Уже в начале 80-х годов ХХ века доказано, что подобно НПВП бло- каторы ФНОа в равной мере смягчают течение как пародонтита, так и ревматоидного артрита. В это время было установлено, что блокатор ФНОа инфликсимаб замедляет резорбцию альвеолярной кости, хотя не способен влиять на глубину пародонтальных карманов. При этом степень воспаления десны может даже увеличиваться. Эти внешне противоречивые данные показались авторам неожиданными и были объяснены тем, что процессы воспаления пародонта могут регулироваться различными механизмами. Воспалительная природа хронического пародонтита предполагает, что он будет подвержен влиянию противовоспалительных препаратов, которые принимаются пациентами в связи с другими заболеваниями: остеоартритом, ревматоидным артритом, аутоиммунными заболеваниями, связанными с поражением глаз, кожи и почек. Основными типами таких препаратов, влияющими на течение пародонтита, являются кортикостероиды, НПВП и недавно появившиеся средства для инактивации ФНОа, широко применяемые для лечения ревматоидного артрита. Кортикостероиды преднизолон, преднизон, бетаметазон и дексаметазон широко используются для лечения хронических воспалительных заболеваний или смягчения их симптоматики. Влияние преднизона на развитие и тяжесть пародонтита исследовали в выборке пациентов с рассеянным склерозом, которые проходили лечение стероидами от 1 до 4 лет. Глубина пародонтальных карманов, степень рецессии десны и потеря альвеолярной кости не различались между группой пациентов, лечившихся стероидами, и контрольной группой. В настоящее время считается доказанным, что даже длительная терапия кортикостероидами не оказывает влияния на течение пародонтита. Этот вывод согласуется с рядом более ранних работ на эту тему. Анализируя природу острого неспецифического ответа на бактериальную инфекцию при хроническом пародонтите, необходимо отметить факт резкого подъема активности MMP, синтезируемых как фибробластами, так и макрофагами пародонта, при возникновении воспаления пародонта любой природы [15]. Особенно существенно то, что в сотни и тысячи раз при этом возрастает активность нейтрофильной коллагеназы MMP8 и желатиназы MMP9 - ферментов, участвующих в конечных стадиях деградации коллагена [16, 17]. На этом основании большинство исследователей делают вывод об аутопротеолитической природе деградации соединительнотканного матрикса пародонта, лежащего в основе пародонтита [7, 17, 18]. При этом роль бактериальных протеиназ в качестве разрушителей коллагена и других компонентов матрикса рассматривается как сигнальная, хотя иногда ей также приписывается существенное значение. Однако этой точке зрения во многом противоречит тот факт, что подъем активности первичных коллагеназ, способных атаковать нативный коллаген в составе внеклеточного матрикса, таких как MMP1 или ММР13, не связан со скоростью поражения пародонта [6]. Между тем активация одних только терминальных матриксинов, даже в несколько раз превышающая базовый уровень, не способна влиять на целостность коллагеновой основы пародонтальной связки. При рассмотрении влияния MMP8 и MMP9 на деградацию матрикса пародонта важным вопросом является регуляторный механизм подъема их активности [19]. Исследования, выполненные молекулярным и иммунологическими методами, показывают существенное увеличение уровня мРНК MMP8 и MMP9 [18, 20] и соот- Original article ветствующих белковых продуктов [21] при поражении пародонта. Однако эти показатели лишь опосредованно отражают уровень активности соответствующих ферментов. Матриксины нормальной ткани присутствуют в форме предшественников, полностью лишенных активности. Активация предшественников происходит по каскадному механизму, причем активация терминальных MMP (желатиназ и стромелизинов) достигается за счет протеолитической активности матриксинов, находящихся в начале сигнального пути. Таким образом, повышенная продукция предшественников MMP8 и MMP9, наблюдаемая при воспалении пародонта, не является достаточным условием для подъема активности терминальных MMP: для этого требуется предварительная активация «праймерных» MMP1, MMp2 и MMP3. Кроме того, присутствие в тканях ингибиторов MMP - TIMP. общая концентрация которых существенно превышает концентрацию любой MMP, позволяет полностью подавлять активность даже тех молекул MMP, которые подверглись протеолитической активации и не имеют в составе пропептида. С учетом сказанного следует констатировать, что роль матриксинов MMP8 и MMP9 в разрушении па- родонтальной связки нуждается в конкретизации, хотя статистическая связь между гиперпродукцией предшественников этих матриксинов и тяжестью пародонтита сомнений не вызывает. Описанным в публикациях моментом, касающимся роли матриксинов MMP8 и MMP9 в развитии хронического пародонтита, является механизм активации синтеза их предшественников регуляторными факторами: хемокинами и лимфокинами. Существуют неопровержимые доказательства того, что продукция MMP8 и MMP9 на пораженных участках пародонта коррелирует с увеличением концентрации в этом месте лимфокинов острого неспецифического ответа ТЫ-типа: ИЛ-1Р, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНОа, лиганда-активатора NF-кВ (RANKL) и остеопроте- герина (OPG). Напротив, повышение концентрации лимфокинов, стимулирующих антигензависимый ответ Th2-rarn - ИЛ-10 и ИЛ-4, - коррелирует с падением продукции предшественников терминальных матриксинов MMP8 и MMP9 [22]. В то же время в этой фазе, как правило, наблюдается повышение уровня синтеза ИЛ-17 - фактора, стимулирующего заживление раневой поверхности после устранения инфекции. При исследовании содержимого пародон- тальных карманов этот процесс удается наблюдать в основном в стадии ремиссии пародонтита. Имеются и прямые доказательства того, что стимуляция культивируемых in vitro фибробластов ТЫ-лимфокинами ИЛ-1р, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНОа и RANKL на 2-3 порядка повышает уровень накопления предшественников металлопротеиназ, прежде всего MMP8 и MMP9: результаты определения мРНК и кодируемых ими белков-предшественников совпадают [23]. Таким образом, лимфокины должны рассматриваться в качестве одного из ключевых факторов активации продукции предшественников MMP в ответ на инвазию. В рамках работы была апробирована система оценки содержания в тканях пародонта мРНК защитных Оригинальная статья факторов организма ФНОа, MMP8 и MMP9. Выбор именно этих транскриптов обусловлен тем, что они наиболее часто упоминаются в литературе в качестве сигнала скорого разрушения пародонта. Многие авторы даже рассматривают их как непосредственную причину распада коллагена пародонтальной связки, приписывая им сугубо негативную роль в течении пародонтита [24, 25]. Материал и методы Клинический материал был собран на базе Центрального НИИ стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Минздрава России. Все пациенты ознакомлены с условиями участия в исследовании и подписали информированное согласие. В исследовании принимали участие 288 человек в возрасте от 21 до 55 лет без тяжелой соматической патологии. В исследуемой выборке 204 пациента имели диагноз хронического генерализованного пародонтита (ХГП) и у 84 пациентов патология пародонта отсутствовала. Выборка состояла из 174 женщин (77 пациенток с ХГП и 97 женщин со здоровым пародонтом - группа контроля) и 114 мужчин (ХГП у 64 пациентов, группа контроля - 50 человек). При обследовании пациентов учитывали наличие и характер жалоб, анамнез, проводили клиническую оценку состояния полости рта и пародонтального статуса (степень тяжести заболевания, наличие гноетечения из пародонтальных карманов, степень подвижности зубов, гигиенический индекс Силнес-Лоэ, индекс кровоточивости Мюллемана). Также учитывалась неблагоприятная наследственность пациентов. Для выделения РНК штифты консервировали в пробирках типа эппендорф объемом 1,5 мл, содержащих по 0,5 мл IntactRNA (консервант для РНК) («Евроген», Россия). Для проведения обратной транскрипции (ОТ) использовали наборы производства ООО «НПО ДНК-Технология» (Россия) согласно инструкции производителя. Смесь ОТ готовили по следующей схеме в стерильной пробирке объемом 1,5 мл: • ОТ-буфер - 2(N+1) мкл; • «праймеры + дНТФ» - (N+1) мкл; • обратная транскриптаза 2 ед/мкл - 0,5 (N+1) мкл, где N - количество анализируемых образцов с учетом отрицательного контроля. В пробирки, содержащие по 16,5 мкл препарата подготовленной РНК, добавляли по 3,5 мкл смеси ОТ. При постановке отрицательного контроля использовали пробирку, содержащую 16,5 мкл очищенной воды. Перемешивали реакционные смеси 5- 7-кратным пипетированием. Пробирки инкубировали при 40 °С в течение 30 мин, затем останавливали реакцию прогреванием при 95 °С в течение 5 мин. Полученный препарат кДНК использовали для проведения ПЦР в реальном времени. Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам вариационной статистики. Проверку гипотезы о достоверности различий между выборками выполняли с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. При анализе взаимосвязей внутри пары количественных или порядковых качественных признаков использовали корреляционный анализ по методу Спирмена. Во всех случаях уровень статистической значимости принимали за 95% (согласно критерию Фишера, p < 0,05). Для статистической обработки результатов использовали программу Statistica 8.0 для Windows (Net Application», США). Результаты и обсуждение При использовании метода Спирмена для анализа корреляций в уровне представленности молекулярных маркеров в общей выборке пациентов выявлено синхронное изменение концентраций мРНК ФНОа/ MMP8/MMP9 с положительной связью (p = 610-4); При анализе корреляций в уровне представленности молекулярных маркеров в контрольной группе пациентов (без ХГП) было выявлено синхронное изменение (с положительной связью) соотношения концентраций мРНК ФНОа/MMP8/MMP9 (р = 10-4): сила связи выше, чем в случае общей выборки без разделения на случай и контроль. Аналогичная корреляция не была обнаружена в группе пациентов с ХГП. По результатам анализа в этой группе синхронно (с положительной связью) изменялись только концентрации мРНК MMP8 и ФНОа (p = 0,054): сила связи на 2 порядка слабее, чем в группе контроля (p = 10-4). Корреляция между содержанием в образцах мРНК ФНОа и MMP9 полностью утрачивалась. Корреляция содержания мРНК MMP8 и MMP9 вместо прямой становилась обратной (p = 0,02). Особенностью группы женщин по сравнению с общей выборкой явилась относительно слабая выраженность связей в кластере признаков мРНК ФНОа/ MMP8/MMP9. Как и в группе пациентов с ХГП, корреляция между уровнем представленности мРНК MMP8 и MMP9 носила отрицательный, а не положительный характер. Корреляция между содержанием мРНК ФНОа и MMP9 не прослеживалась. Корреляция между содержанием мРНК ФНОа и MMP8 положительная, но находилась на пределе достоверности (p = 0,04). Хотя сопоставление степени тяжести симптомов поражения пародонта у мужчин и женщин не выявило статистически значимых различий, анализ выборки мужчин по молекулярным маркерам показал наличие ряда тенденций, не характерных для женщин. Наиболее ярким отличием мужчин явилось наличие устойчивой корреляции между концентрациями мРНК ФНОа, MMP8 и MMP9: парные корреляции характеризовались величиной p = 0,0012, приближающейся к величине этого параметра в выборке здоровых пациентов. Сопоставление выборок некурящих и курящих пациентов позволило выявить серьезные различия, несмотря на то, что в клиническом отношении состояние пародонта в этих группах достоверно не различалось. Для некурящих пациентов характерны высокая сила связи между параметрами комплекса признаков мРНК ФНОа/MMP8/MMP9 -p в диапазоне от 0,00035 до 0,00037, в выборке курящих пациентовр на пределе достоверности: в диапазоне от 0,32 до 0,54. Это наблюдение показывает, что курение вызывает нарушение нормального функционирования сигнальных механизмов, обеспечивающих защиту пародонта от инфекции. Представленные данные свидетельствуют о наличии важных различий в течении пародонтита между мужчинами и женщинами. Важной задачей исследования является выработка концепции, описывающей связь исследуемых молекулярных маркеров с состоянием пародонта и процессами, определяющими это состояние. Решение этой задачи позволяет подойти к созданию метода ранней диагностики развития и оценки эффективности медикаментозного лечения пародонтита. В качестве наиболее важных признаков был выбран возраст пациентов и степень заболевания па- родонта. Пациенты были разделены на 3 возрастные группы: 1-ю группу - пациентов до 35 лет (n = 168), 2-ю группу - от 36 до 55 лет (n = 102), 3-ю группу - 56 лет и старше (n = 18). При анализе представленности маркеров в выборках случая/контроля и мужчин/женщин методом непараметрического сравнения по Манну-Уитни было установлено, что уровень транскриптов ФНОа, MMP8 и MMP9 во всех четырех группах в среднем одинаков. Однако с помощью анализа по Спирмену было установлено, что внутри группы контроля наблюдалась существенно более выраженная корреляция в поведении пар маркеров фНОa/MMP8 и ФнОа/MMP9, чем в генеральной совокупности всех пациентов. Более того, в контрольной выборке была обнаружена корреляция между маркерами MMP8 и MMp9 (R = 5,3 при p = 1,8 10-4), которая не наблюдалась в общей выборке. Это наблюдение позволяет предполагать, что скоординированное изменение уровня продукции ФНОа, MMP8 и MMP9 является необходимым элементом механизма защиты пародонта от патогенов. Разрушение этого механизма, приводящее к хаотической передаче сигналов, характеризует патологическое состояния пародонта. Корреляционный анализ по Спирмену показал, что корреляция в уровне экспрессии MMP8 и ФНОа в группе пациентов с ХГП характеризуется R = 2,0 (p = 5,5 10"2), т. е. сила связи ниже, чем в группе контроля. Корреляция в экспрессии пары ФНОa/MMP9 в группе пациентов с ХГП полностью утрачена. Корреляция в экспрессии MMP8 и MMP9 меняет знак на отрицательный: R = -2,4 (p = 2,110"2). В общей выборке женщин без разделения на лица с ХГП и группу контроля корреляция в уровне представленности маркеров мРНК ФНОa/MMP8/ MMP9 существенно ниже, чем в генеральной совокупности. мРНК ФНОа и MMP9 экспрессируются независимо. Корреляция в экспрессии ФНОа и MMP8 формально выявляется, но находится на пределе достоверности. В отличие от выборки женщин в выборке мужчин без разделения на ХГП и контроль при использовании критерия Манна-Уитни выявляется статистическая Original article связь в экспрессии мРНК ФНОa/MMP8 (R = 3,7 (p = 1,110-3)) и ФНОa/MMP9 (R = 2,7 (p = 1,310"2)). Выявленная скоординированная экспрессия ФНОа с MMP8 и MMP9 может иметь существенное практическое значение. Полученные данные опровергают устоявшееся в литературе мнение о защитной неэффективности и даже вредоносности острого неспецифического ответа ТЫ-типа на пародонтопатогены в отличие от ответа ТЬ2-типа, приводящего к выработке антител. По-видимому, при условии быстрого развития ТЫ-ответ, включающий в качестве сигнальных факторов ФНОа, MMP8 и MMP9, способен эффективно блокировать проникновение во внутреннюю среду организма пародонтопатогенов, прежде всего P. gingivalis. Лишь в случае запаздывания с последующим переходом в хроническую стадию эффективность ТЫ-ответа утрачивается. Описанный механизм, по-видимому, более эффективно срабатывает у мужчин, чем у женщин. Полученные данные позволяют предложить количественные критерии оценки состоянии пародонта, особенно необходимые для проведения лонгитудных тестов средств лечения пародонтита. Эти методы дают возможность проводить раннюю диагностику предрасположенности к пародонтиту в стадии, когда консорциум с участием пародонтопатогенов уже сложился, но деградация пародонта еще не началась. Эти тесты могут также играть роль при оценке эффективности лечения, что позволяет сократить время на подбор препарата для конкретного больного, а также при первичной оценке эффективности новых препаратов и методов лечения. Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (государственное задание № 19.1724.2014/К в сфере научной деятельности).

About the authors

Oksana Aleksandrovna Zorina

Sechenov First Moscow State Medical University; Central Research Institute of Dental and Maxillofacial Surgery of Ministry of Health of the Russian Federation

Email: zorina-cniis@yandex.ru
doctor of medicine, professor, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Central Research Institute of Dental and Maxillofacial Surgery of Ministry of Health of the Russian Federation 199911, Moscow

N. K Aymadinova

Sechenov First Moscow State Medical University

199911, Moscow

O. A Boriskina

Sechenov First Moscow State Medical University; Central Research Institute of Dental and Maxillofacial Surgery of Ministry of Health of the Russian Federation

199911, Moscow

A. B Shevelev

Chumakov institute of poliomyelitis and viral encephalitides

142782, Moscow

References

Supplementary files